0 次观看 • 3:29 分钟 • July 8th, 2025
肠道细胞会产生活性氧（ROS）。适度的活性氧水平可维持细胞稳态，而高水平的活性氧则可能导致细胞死亡。
定量检测活性氧水平 体外从鼠类肠道3D类器官培养开始。这些类器官呈现出类似肠道上皮的结构，具有隐窝样突起，其中含有表达绿色荧光的干细胞。在外周区域还存在绒毛样分化的细胞，围绕着由死亡细胞和碎片组成的中央腔。所有这些细胞均产生不同水平的活性氧（ROS）。
现在，用指定孔中的活性氧（ROS）调节剂处理类器官。根据其性质，调节剂可作为ROS诱导剂或抑制剂。在孵育所需时间后，移除用过的培养基。
向培养物中加入蛋白水解酶，破坏类器官的三维结构，使不同细胞释放到悬浮液中。接着加入一种对活性氧敏感的荧光探针并进行孵育。
探针进入细胞后，与活性氧（ROS）发生反应并被氧化，从而产生红色荧光。用DAPI（一种可与DNA结合的荧光染料）处理细胞，该染料可选择性地染色死细胞的细胞核，从而与活细胞形成对比。
使用流式细胞仪分析DAPI阴性的活细胞，以获得与细胞内活性氧水平相对应的红色荧光信号。根据调节剂的性质不同，诱导剂会提高活性氧水平，而抑制剂则会降低活性氧水平。
在含有类器官的96孔圆底板的阴性对照孔中加入1 µL N-乙酰半胱氨酸储备液。
孵育1小时后，向相应的孔中加入1微升叔丁基过氧化氢储备液，并孵育30分钟。然后使用多通道移液器小心移除培养基，避免扰动贴壁的BMM，将培养基转移至另一块96孔圆底板中。将该板暂置一旁。
接下来，加入 100 µL 胰蛋白酶，使用多通道移液器上下吹打 5 次以破坏 BMM。短暂孵育 5 分钟后，再次通过上下吹打的方式解离类器官。
旋转培养板，倒置弃去上清液。将先前收集在另一块96孔板中的培养基重新加入对应的孔中，并通过上下吹打5次重悬细胞。
接着，加入1 µL荧光探针，孵育30分钟。然后再次离心培养板，用250 µL DAPI溶液重悬细胞。将样品转移至流式管中，并将流式管置于冰上保存。
使用单染样本，针对每种荧光染料优化未染色对照和激光电压的前向散射和侧向散射电压设置。然后，采用适当的设门策略，至少采集 20,000 个事件。