SUMO化检测实验：一种通过免疫印迹法体外检测底物蛋白SUMO化状态的技术

SUMO化是由于小泛素样修饰物（SUMO）与底物蛋白结合而发生的。

SUMO化是指成熟的SUMO多肽被一种酶（E1）激活后，转移到结合酶（E2）的活性位点，进而将SUMO连接到靶蛋白的赖氨酸残基上。另一种连接酶（E3）可增强该相互作用的效率。

进行一项 体外 SUMO化检测实验，首先准备一个含有底物蛋白p53、酶和SUMO肽混合物的离心管，并进行孵育以诱导SUMO化反应。加入含十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液终止反应，随后加热样品使蛋白质变性。

将蛋白质混合物加入SDS-PAGE凝胶的加样孔中，进行电泳。分子量较高的SUMO化蛋白质比其非SUMO化形式迁移更慢，从而产生两条明显的条带。

将凝胶转移至电转装置中湿润滤纸上的印迹膜上，再用一张湿润的滤纸覆盖，通过电转移将蛋白质从凝胶转至膜上。

使用抗 p53 抗体处理膜，该抗体可与 p53 结合。再覆盖能与抗体-p53 复合物结合的酶偶联二抗。加入化学发光底物以产生发光产物，并对膜进行成像。

较高分子量的条带对应于SUMO化蛋白，而较低的条带对应于非SUMO化蛋白变体。

加入3微升浓度为100纳克/微升的纯化tag-K-bZIP 在 体外 SUMO化反应主混合液。然后，轻轻混匀主混合液中的各组分，在30摄氏度孵育3小时。

接着，加入20 µL 2× SDS-PAGE上样缓冲液以终止反应。然后将样品在95 °C下加热5分钟，使蛋白质变性。

接下来，将20微升样品加入10% SDS-PAGE凝胶中，在80伏电压下电泳约120分钟，直至染料迁移至凝胶底部。

电泳结束后，断开电泳装置，将凝胶转移至半干转印缓冲液中浸泡5分钟。然后，将PVDF膜放入另一个盛有甲醇的容器中浸泡1分钟。

将PVDF膜从甲醇中取出，浸入半干转印缓冲液中，然后轻轻振荡5分钟。

取下半干电泳装置的安全盖。将一张滤纸预先润湿，并在铂阳极底部制备凝胶三明治结构。将阴极板固定在安全盖上后，以15伏恒定电流电转90分钟。随后关闭电源，在断开半干电泳装置连接后取出PVDF膜。

现在，将PVDF膜置于封闭缓冲液中，在室温下于30转/分钟的摇床上孵育1小时进行封闭。接着，将PVDF膜与抗p53抗体和封闭缓冲液在4摄氏度下于悬浮混合器上以30转/分钟的速度杂交12至16小时。

然后，取出PVDF膜，转移至含有Tween-20的TRIS缓冲盐水中。接着，将PVDF膜在含Tween-20的TRIS缓冲盐水中于45转/分钟的摇床中浸泡30分钟。随后，将PVDF膜与用封闭缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体在室温下于30转/分钟的振荡混合器中孵育1小时。

接下来，用含吐温-20的TRIS缓冲盐水洗涤PVDF膜三次。洗涤后，将PVDF膜置于含吐温-20的TRIS缓冲盐水中，在45转/分钟的振荡混合器上孵育30分钟。然后，用磷酸盐缓冲液替换含吐温-20的TRIS缓冲盐水，于4摄氏度保存PVDF膜，最长可保存12小时。

接下来，将增强型化学发光底物试剂1和试剂2按1:1比例混合。然后，将PVDF膜从磷酸盐缓冲液中取出，用打孔纸巾短暂吸印以去除多余水分。

立即向膜表面加入 400 微升化学发光试剂，孵育 3 至 5 分钟。短暂吸去多余的化学发光试剂，防止膜完全干燥。使用化学发光成像系统对印迹进行曝光。