荧光素酶检测：利用基于工程化Nano荧光素酶系统的生物报告系统测量发光信号的高通量检测方法

荧光素酶是一种催化其底物氧化生成生物发光产物的酶。

荧光素酶的这一特性有助于设计基于纳米荧光素酶的报告系统，该系统使用酶的分裂版本。在此系统中，较小和较大的片段彼此之间具有高结合亲和力，能够重新构建出具有功能的酶。

要使用基于纳米荧光素酶的系统检测目标蛋白——SARS-CoV-2 刺突糖蛋白的受体结合域，请从含有贴壁细胞的培养皿开始。这些细胞含有编码目标蛋白的质粒，同时包含一段针对工程化纳米荧光素酶小片段的特异性序列。

表达后，培养的细胞会产生生物报告分子——即与荧光素酶的小片段融合的重组靶蛋白。用裂解缓冲液处理细胞，并在振荡条件下孵育。缓冲液组分可快速裂解细胞，将细胞内容物（包括生物报告分子）释放到上清液中。

将上清液转移至多孔检测板中。向每孔加入含有分裂纳米荧光素酶大片段的溶液，并进行孵育。

孵育期间，大片段会自发结合生物报告系统的 小亚基 并形成具有功能的构象。加入含腔肠素（furimazine）——底物的溶液，将检测板放入发光仪中。

该功能性酶可氧化呋喃嗪，产生强烈的发光信号。信号强度与目标蛋白浓度呈正相关。

为了利用荧光素酶检测评估生物报告体的发光信号，首先准备反应组分，并使用上清液作为生物报告体的来源。

使用前将LgBiT和底物稀释至1x。从每个孔或试管中转移50微升上清液至96孔板中，每孔加入50微升1x LgBiT。室温孵育5分钟。

打开化学发光仪软件。向每个孔中加入 50 µL 1× 底物。将板放入化学发光仪中并运行软件。