0 次观看 • 3:32 分钟 • July 8th, 2025
在生物系统中，蛋白质与其特定伴侣分子的接近程度是决定蛋白质-蛋白质相互作用是否成功的关键因素。当存在小分子抑制剂时，这些蛋白质无法相互靠近，从而破坏它们之间的相互作用。
为了筛选能够破坏两种蛋白质（分子伴侣与共伴侣蛋白）之间相互作用的抑制性分子，可使用含有多种小分子的多孔板。向各孔中加入表面固定有共伴侣蛋白的供体微珠。这些微珠含有用于化学发光检测的光敏剂。
加入与伴侣蛋白衍生的肽序列偶联的受体珠混合液，该肽序列可特异性结合共伴侣蛋白。这些珠子含有基于噻吨酮的染料以及可视化所必需的荧光基团。
在含有非抑制性分子的孔中，分子伴侣结合肽与共伴侣蛋白之间的高亲和力会吸引受体珠和供体珠。而当存在抑制剂时，这些微珠则保持分离状态。
使用化学发光仪研究相互作用。在特定波长光照下，供体微珠中的光敏剂会释放出高活性的单线态氧。
在没有抑制性分子的情况下，释放的物质会到达邻近的受体微珠并与染料分子发生反应，从而产生化学发光。该能量激活受体微珠中的荧光基团，导致发光。
相比之下，在含有抑制性分子的孔中，单线态氧会发生衰变，导致无光发射，表明蛋白-蛋白相互作用被成功抑制。
在 PBS 中加入谷胱甘肽供体珠，终浓度为每毫升 10 微克。加入 GST-FKBP51 至终浓度为每毫升 10 微克，并在 25 摄氏度避光孵育反应 10 分钟。
用DMSO对测试化合物进行系列稀释。取0.25微升测试化合物稀释液，每份设三个复孔，加入384孔板每个孔的角落处。
作为阴性对照，在孔中加入 0.25 µL DMSO；作为阳性对照，在孔中加入 0.25 µL Hsp90 C端肽段。
向每个孔中加入 22.5 微升含有谷胱甘肽供体珠和 GST 标签蛋白的溶液。用手充分振荡培养板，并在 25 摄氏度避光孵育 15 分钟。
将连接有Hsp90 C端肽段的受体珠用0.5×PBS稀释至浓度为100微克/毫升。向每孔中加入2.25微升稀释后的受体珠。避光振荡孵育15分钟，操作如图所示。
打开酶标仪，测量样品板的信号，并按照文稿中所述方法分析数据。