0 次观看 • 3:43 分钟 • July 8th, 2025
首先，用缓冲液对包膜感染性病毒——单纯疱疹病毒进行连续稀释。
取一个含易感病毒的上皮细胞单层培养物的多孔板。将特定体积的培养基替换为稀释后的病毒悬液，确保单层细胞均匀覆盖。使病毒吸附到细胞表面。
去除未吸附的病毒。用含有甲基纤维素的培养基覆盖细胞单层，形成半固体覆盖层。
孵育后，病毒包膜与细胞膜融合，将包裹双链基因组的病毒核衣壳释放到细胞质中。随后，病毒基因组被释放进入细胞核。
利用宿主细胞的分子机制和病毒颗粒蛋白，病毒基因组表达即刻早期病毒蛋白，这些蛋白可调控早期基因的表达。早期病毒蛋白介导病毒DNA的复制。
随后，晚期病毒基因表达结构蛋白，这些结构蛋白与病毒基因组组装，产生子代病毒颗粒。感染病毒的细胞发生裂解，释放出病毒颗粒。
甲基纤维素限制病毒的移动，导致病毒颗粒只能感染邻近细胞并引起继发性裂解，从而在单层细胞上形成孔洞。
孵育结束后，去除甲基纤维素覆盖层，加入乙醇结晶紫溶液。乙醇可固定细胞并灭活病毒，而结晶紫对细胞进行染色。结果，在紫色的细胞单层上出现清晰的裂解区域或噬斑。
在每个病毒稀释度的每个孔中计数噬斑，以确定感染性病毒滴度或浓度。
使用移液器从一到两个孔中移除细胞培养基。小心地将稀释后的病毒样本沿每孔侧壁逐滴加入至每层细胞单层中。
每隔一到两个孔重复此步骤，直至整块板的所有孔均加入待进行噬斑实验的病毒样本。用手轻轻摇动整块板。
然后，将培养板置于37摄氏度孵育1小时，以使病毒吸附。每隔10分钟，将培养板从孵育箱中取出，轻轻摇晃以使病毒更均匀地分布于每个孔中，随后重新放回孵育箱中。
为降低意外计数未吸附病毒接种物的可能性，使用1,000微升移液枪头从孔中移除病毒样本，并将样本弃置到废液杯中。
在培养皿中加入2.5毫升甲基纤维素覆盖层，然后将其放回培养箱中。在将废液杯从生物安全柜中取出之前，需对其进行消毒，通常可加入次氯酸钠、碘伏或其他类似的病毒灭活剂。
经过两天的孵育后，使用移液器一次从一个或两个孔中移除甲基纤维素覆盖层，并将其放入废液杯中。向每个孔中加入约 2 毫升 1% 结晶紫溶液和 50% 乙醇。将所有孔均加满染色液的培养板在 37 摄氏度下继续孵育 30 分钟。
此时，按照之前的方法对废液杯进行消毒。用自来水彻底冲洗培养板，直至流出的水变澄清。
确保每个稀释系列之间的噬斑数量相差约10倍。