末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记——TUNEL检测：一种原位检测凋亡细胞中DNA片段化的方法

受微生物病原体感染的宿主细胞会发生凋亡——即程序性细胞死亡。在细胞凋亡过程中，DNA酶将染色体DNA降解成小片段，从而导致细胞死亡。

为了使用TUNEL法检测细胞凋亡，取一张载玻片，其上含有经脱蜡和复水处理的、感染了真菌病原体的皮肤组织切片。

用蛋白酶K处理组织，以灭活细胞内的DNA酶，防止其在分析过程中可能降解DNA。加入过氧化氢以终止反应，并洗涤载玻片以去除未反应的蛋白酶K。

加入含有地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸（digoxigenin-labeled deoxy-uridine triphosphates，dUTPs）的缓冲液。补充末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT），混匀后孵育。在凋亡细胞中，TdT 酶可催化标记的 dUTPs 与断裂 DNA 暴露的 3′-羟基末端共价结合。

接着，加入与罗丹明报告分子偶联的抗地高辛抗体，在避光条件下孵育，以促进抗体与地高辛标记的dUTP结合，成像时呈现红色荧光。

使用荧光核复染剂处理组织样本，以观察细胞核。在组织切片上放置盖玻片，并在荧光显微镜下观察。

蓝色荧光有助于识别组织切片中所有细胞的细胞核，而罗丹明染色细胞中红色荧光的存在则表明由于细胞凋亡导致的DNA片段化。

开始此操作步骤时，按照文本方案中的说明，准备带有样本组织的亲水性玻片。

为脱去组织切片中的石蜡，将载玻片置于考普林瓶中，用二甲苯洗涤三次，每次5分钟。接着，用100%乙醇洗涤载玻片两次，每次5分钟。随后，依次用95%乙醇和70%乙醇各洗涤3分钟，最后用PBS洗涤一次，持续5分钟。

为制备实验组和阴性对照组玻片，通过将新配制的蛋白酶K直接加入玻片对组织进行预处理。室温孵育10分钟，然后用PBS洗涤玻片两次，每次2分钟。

为制备阳性对照切片，先用DN缓冲液预处理组织，然后将切片在室温下孵育5分钟。随后，将DNase I溶解于DN缓冲液中，使其终浓度为0.1微克/毫升。将配制好的DNA溶液加至切片上，于室温孵育15分钟，接着在Coplin瓶中用蒸馏水洗涤切片5次，每次3分钟。

在室温下用 PBS 配制的 3% 过氧化氢溶液淬灭反应，持续 5 分钟。接着，用 PBS 洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。然后，在载玻片的组织上加入平衡缓冲液。室温孵育 10 秒后，轻轻拍去组织切片周围的多余液体。

将末端脱氧核苷酸转移酶用反应缓冲液稀释，然后加入实验组和阳性对照组玻片上的组织中。在37摄氏度的湿化孵育盒中孵育1小时。

此后，将玻片放入盛有工作浓度终止缓冲液的考兰罐中，振荡15秒，然后在室温下孵育10分钟。接着用PBS洗涤玻片3次，每次1分钟，并轻拍去除多余液体。

接着，将已预热至室温的抗地高辛配体直接加到组织上。将切片置于湿化避光孵育盒中，室温孵育30分钟。

孵育完成后，用 PBS 洗涤载玻片，每次 2 分钟，共洗涤四次。轻拍去除多余液体。然后将封片剂加至载玻片边缘，在载玻片上的封片剂中加入 15 微升 DAPI 溶液。每张载玻片加盖盖玻片，并用指甲油封固。置于避光处干燥。

染色过程完成后，立即使用荧光显微镜观察载玻片。

在每块皮肤切片上随机选取位置，以400倍放大倍数拍摄照片。计数经DAPI染色的蓝色细胞，确保每只动物每块皮肤切片中至少有100个细胞可见。接着，计数呈红色单细胞且细胞边界清晰的TUNEL阳性细胞数量。