0 次观看 • 2:54 分钟 • July 8th, 2025
半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7是能够识别靶蛋白中DEVD四肽序列的蛋白酶，可在天冬氨酸残基的羧基末端切割靶蛋白。它们在细胞凋亡（程序性细胞死亡）级联反应中发挥重要作用。
为了评估凋亡细胞中caspase-3/7的活性，首先准备一个含有感染了诱导凋亡真菌的青蛙脚趾皮肤外植体的试管。向试管中加入适量缓冲液和几颗金属珠。
采用珠磨法破碎皮肤细胞，释放细胞内容物，包括caspase-3/7蛋白。离心试管，使细胞碎片和细胞器形成沉淀。吸取富含蛋白的上清液，移入多孔检测板的孔中。
向孔中加入发光型半胱天冬酶试剂。该试剂包含DEVD肽的前发光底物，溶于含有ATP、镁离子和荧光素酶的缓冲溶液中。
混匀孔中的内容物并进行孵育。在孵育过程中，caspase-3/7 会切割发光底物，释放氨基荧光素——即荧光素酶的底物——进入溶液中。
在ATP和镁离子存在的情况下，荧光素酶氧化释放出的氨基荧光素，生成一种生物发光产物。反应过程中产生的光量与半胱天冬酶（caspase）活性成正比。
为了从冷冻的青蛙脚趾样本中提取蛋白质，将样本放入含有100微升样品缓冲液和两颗不锈钢珠的1.5毫升螺口微量离心管中。
使用珠磨机以最高速度裂解细胞。随后将离心管置于冰上 3 分钟，然后离心收集上清液。
在384孔板中进行caspase 3/7检测时，加入10 µL样品缓冲液作为空白对照，并将蛋白提取物以每组三个复孔、每孔10 µL加入。然后，向蛋白提取物孔和空白对照孔中各加入10 µL市售的caspase 3/7检测试剂。随后，轻轻振荡酶标板15秒，使两种试剂充分混匀。
室温避光孵育30分钟。最后，使用发光酶标仪检测样品的发光值。