0 次观看 • 4:48 分钟 • July 8th, 2025
巨噬细胞是一类特化的免疫细胞，可通过吞噬作用清除发生凋亡（程序性细胞死亡）的细胞。
为了评估凋亡细胞的吞噬作用，首先从含有固定样本的玻片开始 果蝇 胚胎细胞，包括被血细胞（无脊椎动物巨噬细胞）吞噬的凋亡小体。
首先，使用封闭试剂处理细胞，以封闭非特异性结合位点。加入可结合 croquemort 受体（血细胞的吞噬作用标志物）的一抗。洗去未结合的过量抗体。
加入与一抗结合的碱性磷酸酶标记的二抗。然后，在玻片上加入适当的显色底物溶液，并进行孵育。孵育期间，碱性磷酸酶与显色底物反应，使血细胞中出现紫色染色颗粒。
接下来，加入含有末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）和地高辛标记的核苷酸的反应混合液。TdT能够催化地高辛标记的核苷酸连接到凋亡小体中DNA断裂片段暴露出的3'羟基末端。
接着，加入与过氧化物酶报告分子偶联的抗地高辛抗体，该抗体可结合至DNA损伤位点的核苷酸。用过氧化物酶特异性的显色底物溶液处理细胞，并进行孵育。过氧化物酶催化底物的氧化反应，产生有色沉淀，使凋亡小体染成棕色。
最后，在光学显微镜下观察细胞。细胞中同时出现紫色颗粒和棕色信号，表明血细胞内含有被吞噬的凋亡小体。
为了使用抗Croquemort抗体对细胞进行免疫染色，首先将载玻片依次浸入甲醇、含0.2% Triton X-100的PBS以及单独的PBS中。接着，在室温下用20微升含5%全猪血清的PBS + 0.2% Triton X-100溶液封闭非特异性结合位点，封闭时间为20分钟。去除多余的封闭液后，加入20微升抗Croquemort抗血清，在4摄氏度下孵育过夜，以标记细胞。
次日早晨，用 PBS + Triton X-100 对载玻片进行 5 次洗涤，每次孵育 10 分钟。最后一次洗涤后，用 PBS 冲洗载玻片 10 分钟。随后，在室温下用 20 微升碱性磷酸酶标记的抗大鼠 IgG 对细胞进行标记，孵育 1 小时。
孵育结束后，按照所示方法用 PBS + Triton X-100 洗涤载玻片五次，随后在缓冲液中浸泡 10 分钟。然后用磷酸酶底物溶液对细胞进行标记，并在光学显微镜下观察细胞。
当血细胞颗粒中出现明显的紫色信号时，移除多余的底物，并将玻片浸泡在添加了EDTA的缓冲液中5至10分钟。孵育结束后，用PBS洗涤两次，每次5分钟，然后用平衡缓冲液处理细胞10分钟。
除去溶液后，加入20微升末端脱氧核苷酸转移酶溶液，37摄氏度下标记细胞1小时。然后从载玻片上移除溶液，将细胞浸入含17毫升水的0.5毫升终止洗涤缓冲液中，孵育10分钟。接着用PBS洗涤三次，每次5分钟，再在室温下用20微升抗地高辛过氧化物酶溶液标记细胞30分钟。
孵育结束后，如图所示，用 PBS 洗涤细胞四次，然后将切片浸入过氧化物酶底物中，每次 30 秒，直至凋亡细胞变为棕色。当染色达到理想效果时，将切片浸入水中以终止过氧化物酶反应。