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生物学技术
0 次观看 • 7:16 分钟 • July 8th, 2025
减数分裂第一次减数分裂前期的卵母细胞具有转录活性；它们产生mRNA并以休眠形式储存。在成熟过程中，当卵母细胞进入中期时，储存的mRNA被翻译成蛋白质。
为了研究 mRNA 的翻译，首先将处于第一次减数分裂前期停滞的小鼠卵母细胞悬浮于一滴培养基中。将持卵针置于单个卵母细胞附近，以固定其位置。
取一支含有报告分子混合物的显微注射移液管。该混合物包含两种不同类型的 mRNA，其中一种编码黄色荧光蛋白（YFP），即与靶基因 3'-非翻译区融合的报告分子；另一种为编码红色荧光蛋白的多聚腺苷酸化 mRNA。
将报告基因混合物注射到卵母细胞中。将显微注射后的卵母细胞在添加了 cilostamide 的成熟培养基中孵育——cilostamide 是一种化学抑制剂，可维持减数第一次分裂前期的阻滞状态。
卵母细胞会翻译带有多聚腺苷酸尾的mRNA，直至红色荧光强度达到平台期，而编码YFP且缺乏多聚腺苷酸尾的mRNA水平则保持不变。
将处理后的卵母细胞转移至不含西洛他唑的成熟培养基中，以促进减数分裂的恢复；同时目标mRNA进行翻译，产生与黄色荧光报告蛋白融合的目标蛋白。
进行时间序列成像，以在固定时间间隔内观察荧光信号。
显微注射的卵母细胞显示出稳定的红色荧光，而黄色荧光随时间逐渐增强，表明报告蛋白的翻译及逐步积累。
首先，使用26号针头在卵泡壁上做一小切口，小心地打开窦状卵泡。用口控玻璃移液管分离带有数层卵丘细胞的完整卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。换用较小的移液管，通过反复吹打，机械去除COCs的卵丘细胞。
吸除去除了颗粒细胞的卵母细胞，并将其置于含有1微摩尔西洛他胺的成熟培养基的培养皿中。将培养皿放入培养箱中孵育2小时，使卵母细胞从卵泡分离所引起的压力中恢复。
取一支10厘米长的硼硅酸盐玻璃毛细管，使用机械拉针仪制备显微注射针。利用加热的灯丝将针尖弯成45度角，以获得最佳注射效果。在聚苯乙烯培养皿中加入20微升的卵母细胞基础采集培养基液滴，并用轻质矿物油覆盖液滴。
通过添加每微升12.5微克的Ypet UTR和mCherry，制备更大体积的报告基因混合液。将分装样品储存于-80摄氏度。解冻后，在20,000 × g 条件下离心2分钟，然后转移至新的微量离心管中。
用注射针吸取约 0.5 微升的报告分子混合液。将持卵管和注射针放入固定装置中，并将其置于卵母细胞收集液滴内。
轻轻敲击持卵管，打开注射针。将卵母细胞置于一滴基础收集培养基中，注入5至10皮升报告分子混合液。将卵母细胞在含1微摩尔西洛他胺的成熟培养基中孵育16小时，使mCherry信号达到平台期。
进行活细胞成像时，为每个注射了报告基因的样本准备一个培养皿，其中包含两滴20微升的成熟培养液。一滴含有1微摩尔的西洛他唑，用于对照组的前期I期阻滞卵母细胞；另一滴不含西洛他唑，用于培养成熟的卵母细胞。用轻质矿物油覆盖液滴，并将其放入培养箱中。
预孵育后，将显微注射的卵母细胞从培养箱中取出，用不含西洛他胺的成熟培养液洗涤四次。另保留部分卵母细胞于含1微摩尔西洛他胺的成熟培养液中，作为前期-I卵母细胞对照组。
将已注射的卵母细胞转移至预先准备好的延时显微镜培养皿中对应的液滴内。使用封闭的玻璃移液管将卵母细胞聚集成簇，以防止记录过程中细胞移动。
将培养皿置于配备发光二极管照明系统、带有环境控制舱的电动载物台的显微镜下，环境控制舱维持在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，具体参数参见文稿中的描述。
通过点击输入延时实验的适当设置 应用程序 然后， 多维 获取。 选择第一个标签页 主要 并选择 延时 多个 阶段位置， 和 多个 波长。
选择标签页 保存 输入实验应保存的位置，然后选择标签页 延时 输入时间点数量、持续时间和时间间隔，然后选择标签页 阶段 打开明场，通过新建窗口并选择来定位卵母细胞的位置 获取， 获取， 和 显示 活体。
找到卵母细胞后，切换回“多维采集窗口”，点击“+”以设定卵母细胞的位置。选择“波长”选项卡，为明场、YFP 和 mCherry 设置三个不同的波长。调整 Ypet 和 mCherry 的曝光时间。然后，单击“采集”开始延时实验。
为了分析 Ypet-3' UTR 的翻译情况，对每个卵母细胞进行两个区域的测量。首先通过点击“椭圆区域”来选中卵母细胞本身，然后点击“矩形区域”选择一个围绕卵母细胞的小区域，用于背景扣除。通过点击“打开日志”，然后点击“记录数据”，将区域测量数据导出至电子表格中。
针对每个单独的卵母细胞以及所有测量时间点，分别对YFP和mCherry波长，从卵母细胞区域的测量值中减去背景区域的测量值。