荧光泄漏实验研究穿膜肽与膜的相互作用

细胞穿膜肽（CPPs）是一类短的、带正电荷的肽，能够与细胞膜相互作用并穿越细胞膜，从而促进细胞非通透性货物的递送。 

研究测试 CPP 的膜通透化潜能 体外 使用细胞膜模拟物时，从大型单层囊泡（LUV）悬浮液开始。

大单层囊泡（LUVs）由磷脂双分子层构成，其中装载了一种膜不可渗透的荧光探针及其相应的猝灭剂配对物。在囊泡内部，由于荧光探针与猝灭剂彼此紧密接近，两者发生相互作用，导致荧光猝灭。 

用移液器将大单层囊泡（LUV）悬液转移至石英荧光比色皿中，用缓冲液稀释。加入磁力搅拌子。将比色皿置于配备磁力搅拌的荧光分光光度计中，以防止运行过程中LUV发生沉降。测定背景荧光，以排除任何LUV泄漏的影响。

以固定时间间隔向LUV悬浮液中加入所需浓度的CPP。

根据CPPs氨基酸残基的疏水性和电荷特性，它们会扰动LUV脂质膜，导致膜的穿透和通透性增加。

囊泡膜的损伤导致荧光探针和淬灭剂泄漏到周围溶液中，增加了它们之间的空间距离。因此，探针表现出荧光。

进一步添加CPP溶液会导致LUV通透性增加以及荧光强度增强。随着CPP的加入，荧光强度增加，表明该肽具有膜通透化潜力。

为测量荧光泄漏，将大单层囊泡（LUVs）用1毫升HEPES缓冲液2稀释至终浓度为100微摩尔，在石英荧光比色皿中进行，并加入磁力搅拌子，以促进实验过程中溶液的均匀混合。

在前100秒内单独测量LUVs以评估背景荧光，然后在接下来的900秒内逐次加入肽溶液 aliquots，通过荧光强度的增加来测量泄漏情况。

为了测量作为阳性对照的100%荧光泄漏，向大单层囊泡（LUVs）中加入1微升Triton X-100以溶解囊泡，从而在分析的最后100秒内实现探针的完全去猝灭。然后，使用公式计算每个时间点的泄漏百分比。