植物组织中可溶性蛋白含量的可溶性蛋白测定

为了定量植物组织中的可溶性蛋白含量，首先在离心管中加入适量研磨后的冻干植物组织。

向试管中加入氢氧化钠（一种碱），并进行超声处理。碱性环境结合机械力可破坏细胞，释放胞内成分，包括大分子物质——可溶性蛋白质和碳水化合物。在较高温度下孵育。

在加热条件下，碱可导致蛋白质水解，生成较小的肽段并增加蛋白质的溶解度。此外，碳水化合物也会发生降解。

离心混合物。收集含有可溶性蛋白的上清液。加入盐酸以中和pH值。

用三氯乙酸（TCA）处理样品。TCA 会破坏蛋白质周围水化层，导致蛋白质聚集并沉淀。

离心并弃去含有三氯乙酸（TCA）的上清液。用预冷的丙酮洗涤蛋白质沉淀，以去除残留的TCA，避免其干扰可溶性蛋白质的定量。

将丙酮风干。用氢氧化钠重悬蛋白质沉淀。用去离子水稀释。转移至多孔板的孔中。

加入考马斯亮蓝 G-250 染料的酸性溶液。在酸性条件下，该染料与溶解蛋白质中的碱性氨基酸残基结合，形成蓝色的蛋白质-染料复合物。

使用分光光度计测量蛋白质-染料复合物的吸光度，该吸光度与植物组织中可溶性蛋白质含量成正比。

首先，将每种组织称取若干份样品，分别放入已标记的1.5毫升微量离心管中。接着，准确记录每份样品的质量。使用微量移液器，向每根离心管中加入500 µL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液。盖紧管盖后，将各管超声处理30分钟。

接下来，将试管放入预热的热水浴中孵育15分钟。随后，在15,000 g 条件下离心10分钟。使用新的移液枪头，将上清液转移至新标记的微量离心管中，每个样本使用新的枪头。

向沉淀中加入 300 微升 0.1 摩尔的氢氧化钠，再次离心 10 分钟。随后弃去上清液，并将其转移至含有第一次离心所得上清液的试管中。

为了中和上清液的pH值，加入11 µL的5.8 M盐酸。使用石蕊试纸确认pH值约为7。

接下来，向每支试管中加入 90 微升 100% 的三氯乙酸。然后将试管置于冰上孵育 30 分钟。在 4 摄氏度下以 13,000 g 离心 10 分钟。小心使用真空泵和玻璃微量移液器吸头去除三氯乙酸。

吸取时务必小心，不要扰动沉淀物。

接下来，用100 µL预冷至-20 °C的丙酮洗涤沉淀。然后，将丙酮置于通风橱中使其蒸发。用1 mL氢氧化钠溶解蛋白质沉淀。可能需要进行额外的加热、涡旋和超声处理步骤。

将每种IgG标准溶液各160微升以三复孔方式加入96孔板中，起始于A1孔。接着，在新的1.5毫升离心管中，将每种样品溶液50微升加入950微升蒸馏水中。然后，将每种稀释后的样品各60微升以三复孔方式加入孔板中，起始于H1孔。向所有空白孔和未知样品孔中各加入100微升蒸馏水。

使用多通道移液器，向板的每个孔中加入 40 微升考马斯亮蓝 G-250 蛋白染料。用针头刺破孔中出现的气泡。随后，将板在室温下孵育 5 分钟。然后，使用微孔板分光光度计在 595 纳米处记录每个孔的吸光度值。