基于荧光素酶的生长检测法定量测定胞内寄生虫繁殖

Toxoplasma gondii——一种单细胞原生动物——是一种专性厌氧寄生虫，仅在宿主细胞内进行繁殖。

为了利用基于荧光素酶的检测方法定量寄生虫的胞内生长，取表达荧光素酶的寄生虫细胞悬液——该酶在与其底物反应时可产生发光现象。将该悬液加入人包皮成纤维细胞培养物中，并孵育适当时间。

寄生虫结合宿主细胞受体并被内化 通过 一种内吞过程，形成寄生泡。该结构为寄生虫的繁殖提供了微环境。

感染后，吸出培养基，去除未被内化的寄生虫。加入含有去垢剂和荧光素（荧光素酶的底物）的裂解缓冲液。缓冲液中的去垢剂可在细胞膜上形成孔隙，彻底裂解细胞，从而释放出荧光素酶。

释放的酶会氧化荧光素分子并发出光。通过检测发光强度来测定荧光素酶活性。使用含有感染宿主细胞的重复孔，在感染后的预定时间点测定荧光素酶活性。

绘制归一化的发光强度随时间间隔的变化曲线，以获得寄生虫生长随时间的倍数变化。发光强度随时间上升表明寄生虫成功增殖。

以对数尺度绘制数值，以计算曲线的斜率，该斜率代表寄生虫的倍增时间。

为了进行基于荧光素酶的Toxoplasma生长检测，首先小心吸出预先接种了人包皮成纤维细胞的96孔微孔板培养物中的培养基，然后以三列五行的格式向各孔中加入150微升无寄生虫的悬浮液。

在细胞培养箱中孵育四小时后，小心吸去每个孔中的培养基，以去除未侵入的寄生虫，并向除第一行外的每孔加入室温的酚红-free培养基。然后，向每块微孔板第一行的每个孔中加入100微升含12.5微摩尔荧光素酶底物的PBS溶液，在室温下孵育10分钟，以确保细胞完全裂解。

孵育结束后，在酶标仪上测定荧光素酶活性。每次读数代表感染后4小时侵入的寄生虫初始数量。在接下来的四天内，每隔24小时重复一次分析，期间不更换培养基。

为计算寄生虫生长的归一化倍数变化，可将每个读数除以感染后4小时的初始读数。然后将寄生虫生长归一化倍数变化的log2值对每个时间点作图，并进行线性回归分析以获得斜率，该斜率代表倍增时间。