荧光素酶检测法用于研究抗寄生虫化学药物对寄生虫的药效

Toxoplasma gondii — 一种原生动物寄生虫 — 仅在具有细胞核的动物宿主细胞内进行繁殖。它通过内吞作用侵入宿主细胞，形成一个寄生泡。在寄生泡内，该寄生虫摄取宿主的胞质蛋白，从而获取生长所需的营养物质。

为了筛选抗寄生虫药物在宿主细胞内对寄生虫的作用效果，取一块含有多个孔的检测板，其中培养有贴壁生长的人类包皮成纤维细胞。

将表达荧光素酶（一种产生生物发光的酶）的Toxoplasma寄生虫等量加入每孔中。孵育，使寄生虫侵入宿主细胞并在寄生泡内生长。

孵育结束后，吸除培养基，去除未被吞噬的寄生虫。向各孔中加入不同浓度的靶向半胱氨酸蛋白酶的抗寄生虫化合物，并进行孵育。 

药物分子进入宿主细胞以到达寄生虫。一旦进入细胞内，药物会抑制寄生虫的半胱氨酸蛋白酶，干扰依赖宿主的寄生虫获取营养的过程，从而阻断其生长。

吸弃含药物的培养基。加入含有荧光素酶特异性底物的检测缓冲液。缓冲液组分可裂解细胞，使寄生虫的荧光素酶氧化底物，产生强烈的发光信号。

检测所有化学抑制剂浓度下的发光强度。随着药物浓度增加，发光强度降低表明该化学抑制剂具有抗寄生虫效果。

为了评估某种感兴趣化合物对Toxoplasma生长的抑制效果，需在96孔微孔板中培养人包皮成纤维细胞，并在接种前至少培养7天；随后每孔加入150微升寄生虫，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育4小时，如图所示。

孵育期间，通过连续稀释法在12孔储液器中配制待测化合物的八个不同浓度。

用1毫升移液器在12孔储液槽中将各化合物以1:3的比例进行稀释，每种混合物需用移液器上下吹吸混匀数次。

感染后4小时，将第2至第9列各孔中的培养基更换为150微升含有不同浓度化合物的培养基，第1列保留常规培养基作为未处理对照。随后将细胞培养物放回细胞培养箱中继续培养96小时，测定每孔的荧光素酶活性，以确定各化合物浓度下的细胞生长抑制百分比。

要将归一化的荧光素酶活性以百分比形式计算，请将每种化合物浓度下的平均荧光素酶活性除以未经处理的寄生虫所得到的平均荧光素酶活性。

然后，使用适当的绘图软件，将归一化的荧光素酶活性对各化合物作图，并计算每种化合物的半数抑制浓度（IC50）。