Msp1提取实验用于研究错误定位的尾锚定蛋白的去除

Msp1是一种位于线粒体外膜的ATP酶，可清除错误定位的尾部锚定（TA）蛋白 通过 其六聚体中心孔道，促进其降解。

为了理解转运机制，将TA蛋白和Msp1共同重建到脂质体中，使其能够整合到脂质双层中。

通过将重建的脂质体加入含有分子伴侣（细胞质质量控制蛋白）的合适缓冲液中来制备反应混合物。这些分子伴侣带有谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）或 GST 酶标签。

向反应中加入三磷酸腺苷（ATP）。Msp1 会与 ATP 分子结合并将其水解。利用水解产生的能量，Msp1 通过其中心孔道转运膜结合的 TA 蛋白。反应混合物中的分子伴侣会结合到被提取的 TA 蛋白的跨膜结构域上。

接下来，将反应混合物上样至亲和纯化柱。该柱中含有与还原型谷胱甘肽（GSH）偶联的树脂。分子伴侣上的 GST 蛋白会与其底物——偶联的 GSH 结合，从而使分子伴侣-TA 蛋白复合物固定在树脂上。

离心柱子以去除仍整合在脂质体中的TA蛋白。现在加入含有过量GSH的洗脱缓冲液。游离的GSH分子会竞争性地取代GST与偶联GSH之间的结合。

用缓冲液洗脱释放的分子伴侣-TA蛋白复合物。分析洗脱液以确认TA蛋白的存在，表明其已从脂质体中移除。

准备用于SDS-PAGE分析的试管。向输入管中加入45微升双蒸水，向流穿管中加入40微升水，向每根管中加入16.6微升4X SDS-PAGE上样缓冲液。

进行提取实验时，配制提取反应液，并用提取缓冲液将终体积调至 200 微升。然后，将提取实验体系置于 30 摄氏度的加热块中预热两分钟。

开始检测时，加入ATP至终浓度为2毫摩尔。在掌上离心机中离心5秒，然后在30°C下孵育30分钟。

孵育期间，取5 µL反应液样品加入输入管中。同时，按照所示方法，为提取测定中的每个样品平衡一个谷胱甘肽旋转柱。

30分钟孵育结束后，向离心管中加入200微升裂解缓冲液，使总体积达到400微升。然后将此反应液加入已平衡的谷胱甘肽树脂中，在4摄氏度下旋转孵育30分钟。

旋转后，离心柱子以收集穿流液，然后从穿流液管中取10微升样品。用400毫升提取缓冲液将树脂洗涤两次，每次洗涤后弃去穿流液。第三次洗涤后，保留穿流液，并从洗涤管中取50微升样品。

接下来，通过将还原型谷胱甘肽加入提取缓冲液中，配制5毫升终浓度为5毫摩尔的洗脱缓冲液。向离心柱中加入200微升洗脱缓冲液，孵育5分钟。然后离心收集穿流液。重复洗脱步骤一次。

第二次洗脱后，从洗脱样品中取 50 微升等分试样，并加入洗脱管中。