β-半乳糖苷酶检测法评估药物诱导的寄生虫细胞毒性

Trypanosoma cruzi 是一种专性胞内寄生虫，以具有鞭毛、不增殖的动基体形态——上鞭毛体侵入哺乳动物宿主细胞，并分化为无鞭毛的无鞭毛体，后者通过二分裂在细胞质中增殖。

增殖后，无鞭毛体重新分化为锥鞭毛体，破坏宿主细胞进入循环系统，导致全身性感染。

为了评估一种受试抗寄生虫药物在体外对Trypanosoma cruzi的细胞毒性潜力，首先需要培养处于所需发育阶段并稳定表达β-半乳糖苷酶的转基因Trypanosoma cruzi寄生虫。

将寄生虫悬浮于合适的培养基中，转移至多孔板，加入适当浓度的待测抗寄生虫药物，孵育。

该药物通过被动扩散穿过寄生虫膜，并被代谢为有毒的中间产物。这些代谢物进入细胞核，导致DNA损伤，抑制蛋白质合成，包括β-半乳糖苷酶，从而对寄生虫的存活能力产生负面影响。

更换含药物的培养基为缓冲液，以防止在测定吸光度时产生颜色干扰。加入β-半乳糖苷酶的底物氯酚红-β-D-半乳糖吡喃糖苷（CPRG）——一种无毒的半乳糖苷类似物，并补充非离子型温和去污剂。孵育。

洗涤剂裂解寄生虫，将β-半乳糖苷酶释放到溶液中。随后，β-半乳糖苷酶水解CPRG，生成氯酚红，形成红色沉淀物。

使用酶标仪测定氯酚红的吸光度。吸光度较低表明β-半乳糖苷酶活性较低，提示该测试抗寄生虫药物在特定浓度下具有较高的细胞毒性潜力。

按照文稿中的描述，将苯硝唑溶液加入锥虫的上鞭毛体、含有无鞭毛体的Vero细胞或前鞭毛体中。然后，将上鞭毛体在28°C下孵育72小时，将前鞭毛体或含有无鞭毛体的感染Vero细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育24小时。

进行比色测定实验时，先加入100微升PBS或相应的培养基以设置空白孔。随后，向每孔中加入40微升CPRG底物溶液和10微升去垢剂溶液，使每孔终体积为250微升，CPRG终浓度为200微摩尔，去垢剂终浓度为0.1%。

在37摄氏度孵育2小时后，使用微孔板分光光度计在595纳米处测定吸光度。