用于测量主动脉瓣间质细胞钙浓度的钙化检测实验

主动脉瓣瓣叶中含有分布于细胞外基质各层的异质性瓣膜间质细胞（VIC）。在受到刺激时，VIC可转化为成骨细胞——即骨基质形成细胞。

成熟的成骨细胞分泌胶原蛋白和骨基质蛋白。这些蛋白有助于成骨细胞附着于基质。最后，细胞内钙离子进入基质微环境，并与磷酸盐共同沉积形成矿化结节，导致主动脉瓣钙化。

为了评估钙化主动脉瓣中的钙浓度，首先在六孔板中培养VICs。弃去培养基，向孔中加入成骨培养基，并进行孵育。

孵育期间，成骨培养基中的胰岛素可刺激VICs向成骨表型分化。这些成骨细胞在成骨培养基中分泌骨基质蛋白和抗坏血酸，从而诱导其形成富含胶原的细胞外基质。

最后，成骨细胞内的钙离子与培养基中的磷酸盐在培养基中形成矿化结晶。

移除培养基，加入盐酸溶液。孵育以使钙离子溶解到溶液中。将含有钙的酸性培养基分配至多孔板的孔中。

加入钙离子敏感性染料并孵育。在酸性环境中，染料分子与钙离子结合，形成紫色的染料-钙复合物。

测定该复合物的吸光度，其与样品中的钙离子浓度成正比。

开始实验前，用70%乙醇清洁生物安全柜，并将DMEM培养基预热至37摄氏度。随后，将每种条件下100,000个细胞接种至6孔板中的完全DMEM培养基中，并在37摄氏度下培养。

24 小时后，将上清液更换为成骨诱导培养基，在 37 摄氏度下培养细胞 7 天，并于第 3 天更换培养基。

7天后，使用Arsenazo III试剂在96孔板中测定钙浓度，并在650纳米处记录吸光度。