0 次观看 • 4:57 分钟 • July 8th, 2025
在斑马鱼中，环境中的细颗粒物（PM）——一种空气污染物——可引起氧化应激诱导的心脏功能障碍。
为了研究颗粒物（PM）对斑马鱼的影响，首先将斑马鱼胚胎暴露于颗粒物来源的可提取有机物（EOM）中，该物质可诱导活性氧（ROS）的生成。
ROS 将 DNA 碱基鸟嘌呤氧化为 8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG），并引起组蛋白 H2AX 的磷酸化，形成 γH2AX——这是 DNA 双链断裂的标志物。
暴露后，解剖斑马鱼心脏并将其置于载玻片上。用一种能够交联蛋白质的固定液处理心脏，以稳定细胞结构。
接着，加入封闭试剂以阻断非特异性结合位点。加入靶向心肌细胞中 γH2AX 和 8-OHdG 的一抗。
接着，加入两种不同颜色的荧光标记的二抗，它们可特异性结合各自对应的一抗的 Fc 区域。最后，用 DAPI 对样本进行染色——一种特异性结合 DNA 的染料，可与 DNA 中富含 AT 序列的小沟结合，形成荧光复合物。
将切片置于荧光显微镜下，观察经EOM处理的斑马鱼胚胎心脏中8-OHdG和γH2AX表达的信号。
心肌细胞中显著增强的荧光强度表明EOM诱导了氧化性DNA损伤和双链断裂。
使用疏水屏障笔在洁净的玻璃载片上画一个圆圈。将50微升4%多聚甲醛与1.25微升PBS混合，制成固定液。然后，将三个解剖后的心脏组织放入一个疏水屏障圈内，在室温下孵育20分钟。
在显微镜下将溶液倾去，并在室温下干燥样品至少 5 分钟。用 PBST 洗涤载玻片三次，每次洗涤 5 分钟。将 50 微升 BSA 加入 1,000 微升 PBST 中，配制成 5% BSA 溶液，并将载玻片置于湿盒中孵育 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。
将溶液倾析，并用 PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。取 2 微升小鼠抗 8-羟基脱氧鸟苷单克隆抗体和 2 微升兔抗 γ-H2AX 多克隆抗体，加入 296 微升 PBST 中稀释，配制成工作浓度的一抗混合溶液。
将心脏样本与50 µL一抗混合溶液在湿盒中于室温孵育至少1小时，或在4°C过夜。
将溶液倾出，并用 PBST 每次洗涤 5 分钟，共洗涤三次。取 1 微升 FITC 标记的山羊抗小鼠二抗和 1 微升 Cy3 标记的山羊抗兔二抗，加入 500 微升 PBST 中稀释，配制成工作浓度的二抗混合溶液。
在室温避光条件下，用二抗孵育样品 1 小时。
倒出溶液，用 PBS 洗涤样品三次，每次洗涤 5 分钟。向样品中加入 20 微升 DAPI 进行细胞核染色，在室温下孵育 30 分钟。将盖玻片盖在载玻片上，并用指甲油封片，以防止干燥和移动。
在荧光显微镜下观察样品，并使用 ImageJ 软件对心脏区域的荧光信号进行定量分析。以 DMSO 对照样品的平均值计算相对变化，并确定数据的统计学显著性。