用于评估离体癫痫模型中细胞死亡的神经元死亡检测法

癫痫——大脑中自发且反复发作的惊厥——可导致神经元细胞死亡。

为了在离体癫痫模型中研究神经元死亡，首先在适当培养基中获取由幼鼠脑组织制备的鼻皮层-海马器官型切片。

器官型脑片包含嗅周皮层和海马。在逐渐去除血清的条件下，这些区域会表现出逐渐发展的癫痫样活动，进而导致癫痫发作引起的神经元死亡。

向培养物中加入所需量的碘化丙啶（PI）——一种荧光染料——并进行孵育。PI 可透过受损的细胞膜进入死亡的神经元，并与 DNA 结合；而具有完整细胞膜的活神经元则无法摄取 PI。

将组织切片置于显微镜载玻片上进行免疫染色。加入通透化-封闭液并孵育。

溶液中的去垢剂分子可溶解膜脂质，在完整细胞的膜上形成孔隙，使其在后续免疫染色步骤中具有通透性。封闭液中的蛋白质被动结合到细胞的非特异性位点，以减少背景染色。

加入能够穿透神经元并与分布于核基质中的神经元特异性核抗原——NeuN——结合的一抗溶液。随后加入荧光标记的二抗，使其与一抗结合。

在载玻片上加入封片剂以固定样本，并用盖玻片封片。在共聚焦显微镜下，呈现双染色的细胞——即 NeuN 染色的神经元呈 PI 阳性——表明神经元死亡。

进行碘化丙啶摄取实验时，应在生物安全柜中操作。

将插入物从孔中取出，向培养基中加入碘化丙啶，使每孔终浓度为 2 微摩尔。在将插入物放回孔中之前，缓慢振荡培养板，注意确保切片下方无气泡。当所有切片处理完毕后，将培养板放回细胞培养箱中。

进行切片免疫染色时，在碘化丙啶孵育结束后，吸去每个孔底部的培养基，然后在每个插入膜的顶部和底部各加入1毫升4%多聚甲醛。

室温孵育一小时后，用 PBS 洗涤切片 2 次，每次 10 分钟，每次使用 1 毫升 PBS，并用疏水笔在显微镜载玻片上画出两个矩形。

使用锋利的刀片从插入物上切下切片，并将每一片放入一个矩形孔中。向每一片切片上加入透化/封闭液，在室温下孵育三小时。孵育结束后，向每一片切片中加入目标一抗，在4摄氏度下孵育过夜。

第二天早晨，用 PBS-Tween 洗涤切片，每次 10 分钟，共洗涤三次，并在室温下用适当的二抗孵育切片 4 小时。随后，按照前述方法洗涤切片，每张切片加入 50 µL Hoechst 溶液，在室温下孵育 20 分钟。

Hoechst 染色孵育后，再次洗涤切片，然后向每张切片加入 50 µL 封片介质。接着将盖玻片覆盖在切片上，并用指甲油封固。

在室温下静置玻片干燥24小时后，通过共聚焦显微镜观察免疫染色和碘化丙啶摄取情况。