一种用于研究受试化合物对线虫中多聚谷氨酰胺介导的神经毒性的抑制作用的检测方法

某些遗传性神经退行性疾病涉及含有长串谷氨酰胺残基的蛋白质，这种结构被称为多聚谷氨酰胺（polyglutamine, polyQ）片段。这些结构不稳定的、易于错误折叠的蛋白质最终会积聚形成有毒的聚集体，对神经元的功能和存活产生负面影响。

为了评估待测化合物在对抗多聚谷氨酰胺（polyQ）介导的神经毒性方面对神经元存活的保护作用，首先准备表达荧光蛋白和多聚谷氨酰胺蛋白的转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）幼虫悬浮液，其表达部位为ASH成对化学感受神经元。

将样品转移至含有培养基和细菌食物来源的多孔板孔中。向其中一组孔中加入待测化合物。密封多孔板，以尽量减少培养基脱水和污染。孵育。

在蠕虫发育过程中，多聚谷氨酰胺（polyQ）蛋白在 ASH 神经元中形成聚集体，导致与聚集相关的神经毒性，并影响神经元存活。

如果存在，测试化合物会进入神经元，并根据其神经保护能力，可能抑制多聚谷氨酰胺（polyQ）蛋白的聚集，减轻相关的神经毒性，从而改善神经元的存活。

收集成虫并离心。用适当的缓冲液重悬虫体，然后转移至含有适当化学麻醉剂的琼脂糖垫片上以进行固定。

使用荧光显微镜观察 ASH 神经元，检测荧光蛋白以判断神经元存活情况。

与对照孔相比，处理孔中荧光信号增强表明神经元存活率提高，提示待测化合物在抑制多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集及其相关神经毒性方面具有神经保护潜力。

为进行多聚谷氨酰胺（polyQ）神经毒性检测，将300至500条同步化的HA759线虫L1幼虫转移至48孔板的每个孔中，每孔加入500微升含有OP50大肠杆菌（E. coli）和5毫克/毫升黄芪多糖的S培养基。密封培养板后，按照所示方法进行培养、收集，并将线虫重悬于M9缓冲液中。

现在准备琼脂糖垫：将 2 克琼脂糖加入 100 毫升 M9 缓冲液中，在微波炉中加热至接近沸腾。将 0.5 毫升熔化的琼脂糖滴加到置于两块 2 毫米厚玻璃板之间的 1 毫米厚显微镜玻片中央，并垂直覆盖另一块玻片。待琼脂糖冷却凝固后，轻轻移除顶部的玻片。

开始ASH神经元存活率检测时，先在琼脂糖垫上加入一滴20毫摩尔的叠氮化钠，然后将15至20条HA759线虫转移至液滴中以固定其活动。轻轻盖上盖玻片。

现在，将载玻片置于配备数码相机的荧光显微镜下。选择40倍物镜和FITC滤光片，以检测线虫头部区域表达GFP阳性的ASH神经元。

每组随机选取50只以上的线虫，统计头部区域具有GFP标记的双侧ASH神经元的线虫数量，然后计算ASH神经元的存活率。