伤口测定评估共培养中小鼠成肌细胞的迁移能力

为了应对伤口，分泌细胞产生旁分泌信号分子来激活成肌细胞——未分化的肌肉细胞。活化的成肌细胞向伤口部位迁移，在那里增殖，导致伤口愈合。

为了在体外评估成肌细胞的迁移能力，请取一个含有小鼠成肌细胞汇合单层的多孔板。使用移液器吸头刮擦单层，在孔内形成线性、无细胞的贴片，模拟伤口部位。

小心地用生长培养基补充孔，不要干扰伤口贴片。

在合适的培养基中取一个膜状插入物，其中包含神经嵴细胞或NCC（分泌细胞）的贴壁培养物。将插入物放入孔内，使底部的 NCC 靠近伤口贴片。将共培养物孵育所需的持续时间。

孵育过程中，NCC 释放与成肌细胞上的特定受体结合的信号分子，从而启动信号级联反应。这种信号传导促进成肌细胞中的肌动蛋白重组，因此，这些细胞在其边缘发育出细胞质投射，例如片状伪足和丝状伪足。这些投射有助于成肌细胞向受伤区域迁移并逐渐重新填充，从而导致伤口愈合。

板置于显微镜下，观察伤口愈合，其程度与共培养中成肌细胞的迁移能力相关。

当细胞达到70%至80%汇合时，从C2C12室孔中取出上清液培养基，并用PBS洗涤细胞一次。

去除PBS后，通过将无菌P10移液器吸头牢固地穿过单个方向，开始刮擦细胞，以跨越细胞单层的整个长度或宽度。一旦细胞被划伤，快速加入 1 毫升 PBS。

接下来，打开电脑和显微镜。将腔室载玻片放在载物台上，然后将物镜拨盘旋转到 5 倍放大倍率。打开成像软件，单击"相机"选项卡，然后单击"实时"按钮以可视化"AxioCam IC"选项卡上的单元。

确保滤光片完全拉出，让光线通过相机和计算机屏幕。手动移动或旋转腔室载玻片，将伤口区域定位在"AxioCam IC"选项卡上的实时图像的中心。要拍摄图像，请单击"捕捉"以打开包含图像的"AxioCam IC"选项卡旁边的"新建"选项卡。

要保存此静止图像，请单击"文件"，选择"另存为"，选择左侧栏上的"桌面"将文件保存到桌面。在文件名框中输入"文件名"，并将图保存为".czi"文件格式。

要将图片另存为".tiff"，请单击"文件"，选择"另存为"，在文件名框中输入"文件名"，单击"另存为类型"按钮，然后从下拉菜单中选择"*.tiff"。

手动重新定位腔室载玻片，以在同一孔中伤口的其他点再拍摄两到三张图像。成像后，从每个孔中取出PBS，并加入1毫升C2C12培养基。

通过手动将含有 O9-1 细胞的插入物放入腔室孔的每个孔中来组装孔插入共培养系统。轻轻地将插入物向下推入孔中，使插入物的底部位于下面的 C2C12 细胞正上方。将孔插入构建体放回培养箱，并让细胞迁移总共 9 至 12 小时。

要确定最佳迁移时间，请在伤口形成后六小时检查细胞，然后每两到三个小时检查一次。当对照条件下的细胞完全覆盖伤口时结束实验。