用于细胞DNA损伤检测的彗星实验

暴露于有害物质会诱导细胞DNA发生单链和双链断裂，从而导致DNA损伤。

为了检测DNA损伤，首先将经化学处理的细胞单细胞悬液与液化的低熔点琼脂糖混合。将该悬液加样至载玻片上，并使琼脂糖凝固，从而将细胞固定于多孔凝胶基质中。

用裂解缓冲液处理细胞。缓冲液中的去垢剂可溶解细胞膜和核膜，而盐则去除与DNA结合的组蛋白，从而形成含有与核基质相连DNA的核质体结构。

将载玻片置于碱性电泳缓冲液中孵育。这会导致DNA解旋并产生单链片段。将载玻片放入电泳装置中，并连接电源。这使得带负电荷的DNA向正极阳极迁移。

未受损的DNA仍局限于核样体内部。相比之下，较小的受损DNA片段开始向阳极移动。这种差异性迁移形成了一种类似彗星的结构，其中未受损的DNA构成彗头，而受损的DNA则构成彗尾。

将载玻片置于中和缓冲液中孵育，使单链DNA片段复性。接着，用荧光染料处理载玻片以染色DNA。在荧光显微镜下观察载玻片。

尾部的强度和长度与细胞DNA损伤程度相关。

首先，配制0.6%的低熔点琼脂糖PBS溶液，并将其置于37摄氏度水浴中。使用永久性记号笔或铅笔在预先包被的载玻片的磨砂端标记姓名、日期和处理信息。

将冷却板放置在平整的台面上，并将两个冷冻的冷却包插入金属表面下方的滑动抽屉中。然后将载玻片放在冷却板上，预冷1至2分钟。离心样品管并移除上清液，立即将样品放回冰上。用200微升0.6%低熔点琼脂糖重悬细胞沉淀，通过移液混匀。

接下来，将80 µL含有细胞的琼脂糖加到预冷的载玻片上，并迅速盖上盖玻片。将凝胶置于冷却板上静置1至2分钟使其凝固。在此期间，准备500 mL裂解缓冲液工作液，并将其倒入裂解槽中。

凝胶凝固后，用拇指和食指轻轻夹住载玻片，迅速将盖玻片从凝胶上滑下并移除。然后将载玻片放入载玻片架中，确保所有载玻片上的黑色圆点标记朝向同一方向。将载玻片架放入裂解皿中，盖上裂解皿盖子，进行孵育。

小心地将载玻片架从裂解皿中取出，避免扰动凝胶。轻轻地将载玻片架放入预先装有冰冻双蒸水的洗涤皿中。确保载玻片完全浸没，并静置30分钟。

将冷冻的冷却包置于电泳槽下方，以维持缓冲液的最佳温度。然后向槽中加入冰冷的电泳工作液，并将载玻片架转移至其中。调整载玻片方向，使含有细胞的凝胶端朝向阴极。

将载玻片放入电泳槽中孵育20分钟，以使DNA解链。然后接通电源，在每厘米1.19伏的电压下进行电泳20分钟。电泳完成后，关闭电源，从电泳槽中取出载玻片架。将载玻片架置于滤纸上沥干30秒。

接下来，将载玻片架放入含有中和缓冲液的培养皿中，静置20分钟。随后，将其转移至含有冰冻双蒸水的洗涤培养皿中，继续静置20分钟。洗涤完成后，从水中取出载玻片架，将载玻片置于37摄氏度的培养箱中干燥1小时。

为了使切片复水，将切片架转移至含有冰冻双蒸水的洗涤皿中，静置30分钟。随后，将切片架放入含有2.5 µg/mL碘化丙啶溶液的染色皿中。

盖上染色缸的盖子，在室温下避光孵育 20 分钟。孵育结束后，将载玻片架转移至另一个染色缸中，用冰冻的双蒸水洗涤 20 分钟。

从培养皿中取出载玻片架，并在避光条件下完全干燥，可置于37摄氏度培养箱中或室温下干燥。载玻片完全干燥后，将其存放在避光的载玻片盒中，直至进行图像分析。