放射性标记氨基酸摄取检测法用于定量细胞对氨基酸的摄取

氨基酸转运蛋白是定位于细胞膜上的蛋白质，介导氨基酸跨细胞膜的转运，调控重要的细胞生命活动。

为了在体外研究氨基酸摄取，取小鼠骨髓来源的基质细胞培养物。吸除生长培养基。加入含有放射性氢标记的谷氨酰胺（一种氨基酸）的预温缓冲液。孵育所需的时间。

预热的缓冲液提供了细胞摄取谷氨酰胺所需的生理温度和适宜的pH值。谷氨酰胺转运蛋白包含负责底物转运的转运结构域 通过 钠离子偶联共转运——以及膜锚定支架结构域。

转运结构域与缓冲液中的放射性标记谷氨酰胺及钠离子结合。结合后，将这些分子释放到细胞质中。同时，转运结构域将细胞内的钠离子和中性氨基酸转运至细胞外，从而维持细胞内环境的稳态。

用预冷的缓冲液洗涤细胞，以终止反应并去除细胞外的放射性标记谷氨酰胺。加入去污剂溶液。去污剂可裂解细胞，使细胞内的放射性标记谷氨酰胺释放出来。

离心裂解液。将含有谷氨酰胺的上清液加入含有闪烁液的小瓶中，并将小瓶放入闪烁计数器内。

放射性标记的谷氨酰胺分子会释放高能β粒子。混合液中的闪烁剂吸收这些粒子后发出光脉冲，由闪烁计数器检测。

测量放射性以评估细胞对谷氨酰胺的摄取。

开始氨基酸摄取实验时，将5 × 10⁴个ST2细胞接种于12孔细胞培养板的每孔中，培养基为添加了胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的α-MEM培养基。额外接种若干孔细胞，用于测定各实验条件下细胞数量，以便后续归一化处理。

接着，将细胞置于含5%二氧化碳、37摄氏度的湿润化细胞培养箱中孵育两到三天，直至细胞融合。孵育结束后，吸除培养基，用1毫升pH为7.4的PBS缓冲液洗涤细胞两次。然后吸除PBS，再用1毫升克雷布斯-林格缓冲液（Krebs Ringers HEPES，KRH）洗涤细胞一次。

将细胞与0.5毫升新鲜配制的KRH工作液共同孵育5分钟，该工作液中含有4微居里/毫升的L-[3,4-³H]-谷氨酰胺。孵育结束后，收集放射性培养基并转移至液体废物容器中。随后用预冷的KRH洗涤细胞3次，以终止反应。

接着，向每个孔中加入 1 毫升 1% 十二烷基硫酸钠，吹打混合物 10 次以裂解并均质化细胞。然后，将细胞裂解液转移至 1.5 毫升离心管中，并以至少 10,000 g 的离心力离心 10 分钟，以澄清裂解液。

将上清液转移至含有8 mL闪烁液的闪烁瓶中，使用闪烁计数器以每分钟计数（cpm）读取放射性。

从剩余的非放射性细胞培养板中，用胰蛋白酶消化、重悬并计数细胞，以估算裂解的放射性培养物中的细胞数量。使用血细胞计数板，对每种实验条件下每个非放射性孔中的细胞数量进行计数。