测试样品中乳酸含量的比色测定法

在活细胞中，厌氧条件下，乳酸脱氢酶将糖酵解的终产物丙酮酸转化为乳酸——一种关键代谢物。细胞中产生的乳酸量反映了其代谢状态。

为了定量细胞内乳酸浓度，首先使用无蛋白的线虫细胞裂解液作为测试样品。在多孔板的其他孔中加入已知不同浓度的乳酸溶液。

裂解液缺乏所有蛋白质类酶，包括内源性乳酸脱氢酶，从而确保乳酸定量的准确性。

向每个孔中加入乳酸检测试剂缓冲液，以维持适宜的 pH 值，确保酶活性最优化。向孔中补充含有乳酸脱氢酶、辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）以及比色探针的反应混合液，并进行孵育。

孵育过程中，乳酸脱氢酶催化细胞内乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD还原为NADH。生成的NADH与比色探针反应，产生紫色产物。

在570纳米处，用分光光度法测定待测样品和乳酸标准品的紫色溶液的吸光度。绘制乳酸标准品的吸光度值并生成标准曲线。

最后，将样品的吸光度值与乳酸标准品进行比较，以确定测试样品中乳酸的含量。

为了测定乳酸浓度，使用比色法检测试剂盒对测试样本进行重复分析。向96孔板的每个孔中加入10微升测试样本，然后向每个样本中加入乳酸检测缓冲液，调整总体积至50微升。

将100毫摩尔的L(+)-乳酸标准品用乳酸检测试剂缓冲液稀释至1毫摩尔。然后，向一系列孔中分别加入0、2、4、6、8和10微升稀释后的L(+)-乳酸标准品。每孔加入50微升反应混合液，在室温下避光孵育至少30分钟，以使颜色充分显色。

最后，使用酶标仪在570纳米波长下测定每个孔的吸光度。用反应混合液的吸光度减去背景对照混合液的吸光度。然后绘制乳酸标准曲线，并根据曲线计算乳酸浓度，将每个浓度乘以2.25。