用于定量检测样品中乳酸的比色法

在活细胞中，在厌氧条件下，乳酸脱氢酶将丙酮酸（糖酵解的最终产物）转化为乳酸（一种关键代谢物）。细胞中产生的乳酸量反映了它们的代谢状态。

要量化细胞内乳酸浓度，请从无蛋白线虫细胞裂解物的测试样品开始。用各种已知浓度的乳酸溶液补充多孔板的其他孔。

裂解物缺乏所有蛋白质酶，包括内源性乳酸脱氢酶，确保准确的乳酸定量。

每个孔中加入乳酸测定缓冲液，以保持适当的 pH 值以获得最佳酶活性。用含有乳酸脱氢酶、烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸 — NAD — 辅酶和比色探针的反应混合物补充孔并孵育。

孵育过程中，乳酸脱氢酶催化细胞乳酸氧化为丙酮酸，同时将 NAD 还原为 NADH。生成的NADH与比色探针反应产生紫色产物。

谱测量紫色溶液对 570 纳米处测试样品和乳酸标准品的吸光度。绘制乳酸标准品的吸光度值并生成校准曲线。

最后，将样品的吸光度值与乳酸标准品进行比较，以确定测试样品中乳酸的含量。

要测量乳酸的浓度，请使用比色测定试剂盒对测试样品进行重复分析。将 10 微升测试样品添加到 96 孔板的每个孔中，然后向每个样品中加入乳酸测定缓冲液，以将体积调节至 50 微升。

乳酸测定缓冲液将 100 毫摩尔 L（+）-乳酸标准品稀释至 1 毫摩尔。然后，在一系列孔中加入0,2,4,6,8和10微升稀释的L（+）-乳酸标准品。向每个孔中加入 50 微升反应混合物，并在避光室温下孵育至少 30 分钟以使颜色显现。

最后，使用酶标仪测量每个孔在570纳米处的吸光度。从反应混合物的吸光度中减去背景对照混合物的吸光度。然后，绘制乳酸标准曲线，并通过将每个浓度乘以 2.25 来计算曲线中的乳酸浓度。