乳酸脱氢酶依赖性为何对靶点验证至关重要？

该检测依赖外源性乳酸脱氢酶将乳酸转化为丙酮酸，确保信号生成不会受到裂解液中内源性酶的干扰。这种依赖性使得比色信号可特异性归因于乳酸浓度，从而支持在代谢通路中进行准确的靶点验证。

将乳酸作为自变量进行分离如何契合发现流程？

通过量化不同实验条件下乳酸的水平，该检测方法将乳酸作为糖酵解通量的可测量输出指标，使研究人员能够将基因或药物干预与能量代谢的变化联系起来。这通过提供一个降低风险的、定量的通路活性生物标志物，支持早期研究发现。

570 nm 处的定量吸光度测量能够实现什么？

在进行背景扣除后，采用570 nm处的吸光度读数，根据已知乳酸浓度生成标准曲线，从而推算待测样品中的乳酸水平。该定量结果可用于在筛选实验中进行剂量-反应分析以及不同实验组之间的比较。

为何重复分析要求对跨职能协作至关重要？

对每个样本进行重复测量可提高数据的可靠性，并减少技术性变异，这对于生物学、筛选和分析团队之间的一致性解读至关重要。该做法有助于发现阶段与临床前研究单位之间的可重复交接。

实施前需要具备哪些统计分析能力？

团队必须能够生成标准曲线，进行线性回归，并根据曲线插值计算未知样品的浓度，随后进行稀释因子校正（例如，按照实验方案中的说明乘以2.25）。这些步骤可确保从原始吸光度数据中准确量化乳酸含量。

测试样品中乳酸含量的比色测定法

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学技术

0 次观看 • 3:08 分钟 • July 8th, 2025

在活细胞中，厌氧条件下，乳酸脱氢酶将糖酵解的终产物丙酮酸转化为乳酸——一种关键代谢物。细胞中产生的乳酸量反映了其代谢状态。

为了定量细胞内乳酸浓度，首先使用无蛋白的线虫细胞裂解液作为测试样品。在多孔板的其他孔中加入已知不同浓度的乳酸溶液。

裂解液缺乏所有蛋白质类酶，包括内源性乳酸脱氢酶，从而确保乳酸定量的准确性。

向每个孔中加入乳酸检测试剂缓冲液，以维持适宜的 pH 值，确保酶活性最优化。向孔中补充含有乳酸脱氢酶、辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）以及比色探针的反应混合液，并进行孵育。

孵育过程中，乳酸脱氢酶催化细胞内乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD还原为NADH。生成的NADH与比色探针反应，产生紫色产物。

在570纳米处，用分光光度法测定待测样品和乳酸标准品的紫色溶液的吸光度。绘制乳酸标准品的吸光度值并生成标准曲线。

最后，将样品的吸光度值与乳酸标准品进行比较，以确定测试样品中乳酸的含量。

为了测定乳酸浓度，使用比色法检测试剂盒对测试样本进行重复分析。向96孔板的每个孔中加入10微升测试样本，然后向每个样本中加入乳酸检测缓冲液，调整总体积至50微升。

将100毫摩尔的L(+)-乳酸标准品用乳酸检测试剂缓冲液稀释至1毫摩尔。然后，向一系列孔中分别加入0、2、4、6、8和10微升稀释后的L(+)-乳酸标准品。每孔加入50微升反应混合液，在室温下避光孵育至少30分钟，以使颜色充分显色。

最后，使用酶标仪在570纳米波长下测定每个孔的吸光度。用反应混合液的吸光度减去背景对照混合液的吸光度。然后绘制乳酸标准曲线，并根据曲线计算乳酸浓度，将每个浓度乘以2.25。