0 次观看 • 4:00 分钟 • July 8th, 2025
糖原合酶——糖原合成中的关键酶——切割尿苷二磷酸 葡萄糖，或尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖，一种核苷酸糖）分解为尿苷二磷酸（UDP）和糖基残基，并将释放的葡萄糖单体添加到正在延长的糖原链上。
为了估算糖原合酶活性，首先取一支试管，其中含有糖原、尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的反应混合物。加入核苷二磷酸（NDP）激酶酶，以及丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶酶的混合液。 混匀内容物后，进行孵育。
向试管中加入含有糖原合酶的样品以启动酶促反应。
糖原合酶作用于UDP-葡萄糖，生成UDP和一个糖基残基。该酶捕获游离的葡萄糖单体，并将其掺入反应混合物的糖原链中。在ATP存在的情况下，反应混合物中的核苷二磷酸激酶（NDP激酶）对未使用的UDP进行磷酸化，将其转化为UTP，并生成ADP。
丙酮酸激酶作用于ADP，并利用反应混合物中的磷酸烯醇式丙酮酸提供的磷酸基团生成ATP和丙酮酸。接着，乳酸脱氢酶将丙酮酸转化为乳酸，并在反应过程中氧化NADH。
通过测定 340 nm 处 NADH 吸光度的降低来定量消耗的 NADH 量，以指示酶活性的成功实现。
首先进行糖原合酶活性的测定，将先前配制的UDP-葡萄糖、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸和NDP激酶的储备溶液置于冰上解冻。将水浴预热至30摄氏度。
当储备液准备好后，根据糖原合酶检测的数量，按照文本方案中的说明，将试剂加入15毫升离心管中，配制足够量的检测混合液。
通过用水替换反应混合物中的NADH来制备空白反应，并将反应液转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。使用该空白反应在340纳米波长下将分光光度计调零。
取770微升反应混合物至1.5毫升离心管中，依次向管中各加入2微升NDP激酶以及2微升丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合液。
轻轻混匀后，将试管置于水浴中，在 30 °C 下孵育 3 分钟，以预热反应混合物。然后加入含有糖原合酶的样品 30 µL（溶于 pH 7.8 的 20 mmol/L Tris 缓冲液中），轻轻混匀，再将反应混合物转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。
将比色皿放入分光光度计中，在10至20分钟内定时记录340纳米处的吸光度。然后，以吸光度对时间作图。