$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
在哺乳动物的眼球中,脉络膜位于巩膜与视网膜之间,其中含有血管周围巨噬细胞以及脉络毛细血管——一层由周细胞包被的毛细血管网,为视网膜提供氧气和营养物质。在多种血管性眼病中,脉络毛细血管会发生异常的血管新生。
研究脉络膜毛细血管异常出芽 离体 取收获的小鼠眼球外植体,其中包含与巩膜和视网膜色素上皮(RPE)相连的脉络膜。
向多孔板的孔中加入基底膜提取物(BME)液滴——一种富含细胞外基质蛋白的水凝胶。将外植组织置于液滴中,避免组织压平。让BME凝固。
加入含有内皮细胞或内皮细胞特异性生长因子的培养基。孵育。视网膜色素上皮细胞(RPE)分泌血管内皮生长因子,该因子与内皮细胞特异性生长因子共同促进毛细血管内皮细胞的增殖。
固化的BME形成一种细胞外基质,可促进增殖的内皮细胞形成出芽状毛细血管样管状结构。周细胞迁移并附着于这些出芽的毛细血管,促进毛细血管内皮细胞的成熟。
出芽区域的活化巨噬细胞分泌酶以降解布鲁赫膜——脉络膜最内层——从而使芽状结构迁移至视网膜色素上皮(RPE)。
在显微镜下观察出芽的毛细血管。使用适当的软件,测量脉络膜出芽所覆盖的面积。
较大的脉络膜出芽面积表明外植体中脉络毛细血管正在持续出芽。
在24孔组织培养板的每个孔中央加入30 µL解冻的BME。确保BME液滴在孔底部形成凸起的圆顶状,且不接触孔壁边缘。
将组织置于BME中央,不要压平脉络膜外植体,让组织在BME中自然展开。将培养板置于37摄氏度下孵育10分钟,使凝胶固化。随后,向每孔中加入500 µL完全培养基。每隔一天更换一次培养基。
使用显微镜观察,可在三天后看到脉络膜出芽现象。使用 Image J 打开脉络膜出芽图像,并通过灰度模式选择“图像 | 类型 | 8位”。然后通过选择“图像 | 调整 | 亮度/对比度”并进行调节,以优化对比度。
使用“魔棒”功能勾勒并去除存在于芽状结构中心的脉络膜组织。使用自由选择工具去除图像的背景。
接下来,进入 "图像 | 调整 | 阈值",使用 "阈值" 功能将微血管 sprouts 与背景及周边区域区分开。点击 "F2",系统将显示汇总结果。点击 "保存",将选定区域的图像保存至与原始图像相同的文件夹中,以供后续参考。
测量完一组样本后,复制记录的数据以进行分析。