时间分辨福斯特共振能量转移法用于监测细胞内蛋白质磷酸化

某些细胞蛋白的磷酸化是一种关键的调控机制，可导致其激活或失活。

为了监测特定蛋白质的磷酸化，取一个含有贴壁细胞的培养板。用刺激剂处理细胞，以促进细胞内蛋白质的磷酸化。吸除废弃培养基，加入细胞裂解缓冲液和磷酸酶抑制剂混合物。

缓冲液组分可导致细胞裂解，释放细胞内容物以及磷酸化和非磷酸化的蛋白质。抑制剂混合物可使细胞内的磷酸酶失活，从而保持磷酸化蛋白质的完整性。

将细胞裂解液转移至低体积检测板中。加入连接不同光敏荧光基团的供体抗体和受体抗体处理裂解液。

孵育过程中，供体抗体识别测试蛋白上的特异性表位，从而能够结合该蛋白的磷酸化与非磷酸化形式。相比之下，受体抗体仅特异性结合测试蛋白的磷酸化形式。

这种结合使磷酸化蛋白变体中的受体荧光基团靠近供体荧光基团。这种邻近关系触发了弗örster 峰值能量转移（Förster resonance energy transfer, FRET）——即两种光敏荧光基团之间的一种依赖于距离的能量转移现象。

使用兼容FRET的酶标仪读取酶标板。

在光照下，供体荧光基团被激发，进而触发向受体分子的能量转移，后者发出长寿命的荧光信号，该信号与细胞中待测蛋白的磷酸化水平相关。

进行检测时，将预优化密度的细胞在适当的培养基中加入96孔组织培养处理板，每孔50微升。然后，在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。

次日，在聚丙烯96孔板的12个孔中，通过将待测化合物在无血清培养基中进行连续稀释，制备两倍和四倍的中间稀释系列。进行细胞刺激时，加入50 µL含有刺激物（2倍浓度）的无血清培养基，将细胞在室温或37°C条件下孵育预先优化的时间。

进行细胞抑制时，加入25微升含有抑制剂的无血清培养基（抑制剂浓度为4倍浓度），在室温或37摄氏度下孵育预优化的时间。然后，加入25微升含有刺激剂的无血清培养基（刺激剂浓度为4倍浓度），继续孵育预优化的时间。接着，为了裂解细胞，配制1倍浓度的添加型裂解缓冲液，并向其中加入磷酸酶抑制剂混合物。

小心移除并弃去细胞培养基后，立即加入 50 微升 freshly prepared 1× 添加型裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。

对于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测，使用1×检测缓冲液配制4×抗体检测混合液。然后，在1×检测缓冲液中分别配制Eu-Ab1与FR-Ab2抗体溶液，以及Eu-Ab3与FR-Ab4抗体溶液。最后，将预稀释的Eu-Ab1与预稀释的FR-Ab2混合用于磷酸化蛋白的检测，将预稀释的Eu-Ab3与预稀释的FR-Ab4混合用于总蛋白的检测。

然后，小心地将96孔培养板中的15微升细胞裂解液移取至白色低体积384孔微孔板的一个孔中。接着，分别向不同的检测孔中加入15微升阳性对照裂解液和15微升1×裂解缓冲液作为阴性对照。

向含有15微升裂解液的孔中加入5微升相应的4X抗体检测混