基于发光法的检测方法用于评估受试化合物对神经元的神经毒性

神经突生长——即神经元发育出突起的过程——对神经功能和再生至关重要。

评估促进神经突生长的受试化合物的神经毒性效应 体外获取人神经祖细胞（hNPC）悬液，并置于分化培养基中。

将细胞接种到包被有多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白的多孔板孔中，以促进细胞贴附于孔底并支持细胞生长。分化培养基成分可促进人神经前体细胞向神经元分化。

用促进神经突生长的待测化合物处理一组孔板。该化合物与hNPC来源的神经元相互作用，可能诱导神经突生长，同时不干扰细胞代谢过程及三磷酸腺苷（ATP）的后续浓度——ATP是细胞的主要能量来源。

加入含有去垢剂、荧光素酶、荧光素酶底物荧光素、ATP酶抑制剂以及镁离子的单步试剂，并混匀。

洗涤剂会破坏细胞膜，导致细胞裂解和细胞内ATP释放到溶液中。ATP酶抑制剂可抑制释放的内源性ATP酶，避免其干扰ATP的测定。离心，沉淀细胞碎片。

孵育过程中，释放的ATP与镁离子共同作用，促使荧光素与荧光素酶结合，导致荧光素被氧化为高激发态的氧荧光素，当其回到基态时会释放出一束生物发光光子。使用酶标仪检测发光强度，以反映ATP浓度。

较高的ATP浓度代表较高的细胞活力，表明受试化合物对神经元无明显毒性。

为包被培养板，向384孔板的每个孔中加入30微升聚-L-赖氨酸，在室温下孵育1小时。用PBS洗涤两次，然后使其干燥约30分钟。

每孔加入 30 微升层粘连蛋白，然后在 37 摄氏度下孵育 2 小时。用 PBS 重复洗涤，随后进行细胞接种。在 25 微升分化培养基中加入 20,000 个单细胞神经球，接种至 384 孔板的每孔中，并在 37 摄氏度下孵育 5 天。

接种解离为单细胞的神经球时，需要高精度的移液技术，以确保接种数量准确。因此，建议在接种前先将神经球分化为神经元，以获得更可重复的实验结果。

孵育结束后，向每个孔中加入5 µL测试化合物，使其浓度为所需浓度的6倍，然后将细胞再孵育24小时。

为进行细胞活力检测，向每孔中加入30微升发光试剂，并将培养板置于摇床上孵育2分钟。随后以300至400 × g离心培养板 g 孵育30秒。然后在室温下避光孵育10分钟。孵育结束后，使用微孔板读板仪检测发光信号。