分裂荧光素酶互补测定以鉴定特定的蛋白质-蛋白质相互作用

0 views • 4:02 min • July 8th, 2025

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蛋白质-蛋白质相互作用对于重要的细胞功能至关重要。

要研究跨膜蛋白(跨越细胞膜脂质双层的膜蛋白)之间的相互作用,请从含有贴壁哺乳动物细胞培养物的多孔板的孔开始。

接下来,加入含有合适转染剂和一对表达质粒的溶液。

其中一种表达质粒编码与荧光素酶的小非功能片段融合的目标跨膜蛋白;另一个质粒编码与荧光素酶的大非功能片段融合的第二目的跨膜蛋白。

育板。转染剂促进表达质粒的细胞摄取。

成功转染的细胞表达跨膜蛋白。表达的跨膜蛋白之间的相互作用使面向细胞质的小片段和大片段靠近,使它们结合并形成活性荧光素酶。

无血清培养基替换孔中的培养基,以尽量减少背景发光。加入呋嗪(一种细胞渗透性荧光素酶底物)溶液。呋喃嗪进入细胞,随后荧光素酶氧化呋喃嗪,产生高强度发光。

使用酶标仪测量发光,这表明跨膜蛋白之间存在强烈的相互作用。

通过胰蛋白酶消化收获贴壁HEK293T细胞培养物,并将细胞重新悬浮在专用的完全生长培养基中。将细胞接种到透明底部、白色面的 96 孔板上。调整孔的总数以适应所有测试的组合和对照,包括重复。然后,在标准条件下培养细胞过夜。

第二天,用所需的表达质粒组合转染细胞。将质粒在无血清培养基中稀释至每个构建体每微升 6.25 纳克,并以适当的脂质与 DNA 比例加入基于脂质的转染试剂。

根据制造商的说明孵育质粒。然后,将 8 微升脂质-DNA 混合物添加到指定孔中。轻轻旋转混合板中的内容物,并在标准条件下培养细胞20至24小时。

第二天,用 100 微升无血清培养基替换每个孔中的条件培养基,确保细胞在培养基交换时不会脱落。

测量发光之前,将一体积的呋马嗪与19体积的稀释缓冲液混合。将 25 微升呋马嗪工作溶液加入每个孔中,并用手或用轨道摇床轻轻混合板。

板插入发光酶标仪中,并在 37 摄氏度下平衡板 10 至 15 分钟。选择要分析的孔,并以 0.3 秒的积分时间读取发光。必要时继续监测发光长达两个小时。

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Last updated: 18 July 2026