用于靶基因中插入缺失突变检测的数字滴定聚合酶链式反应

数字滴定PCR可检测插入缺失突变——即DNA中核苷酸的随机插入或缺失。该方法通过将样本分割成微小液滴，并对每个液滴中的DNA进行独立扩增来实现。

进行数字滴液PCR（ddPCR）时，取含有目标基因野生型和突变型变异的DNA样本。将样本混合物和油分别加入含有微流控通道的液滴生成器室的不同区域。

样品和油快速流经狭窄通道，在交汇处乳化，并被分割成多个液滴，每个液滴含有少量DNA分子。

现在，取一个PCR板，其中含有缓冲液、正向和反向引物、dNTPs、耐热DNA聚合酶，以及两种分别标记了不同荧光基团和淬灭分子的探针。每种探针特异性针对一种特定类型的等位基因——野生型或突变型。

将液滴转移至PCR板中。将PCR板放入热循环仪，运行反应程序。在变性过程中，DNA双链解离；在退火温度下，引物和探针与模板DNA结合。

带有绿色和橙色荧光基团的探针分别结合到野生型和突变型DNA序列上。随后，DNA聚合酶延伸引物，将探针上的荧光基团和淬灭基团切断，从而产生荧光信号。

分析扩增产物。显示绿色荧光的液滴含有野生型DNA序列，而橙色荧光则表明存在插入缺失突变。

首先，按照文中所述比例加入数字滴定聚合酶链式反应（ddPCR）超级混合液、正向和反向引物、HEX 或 FAM 探针、DNA 和水，配制 25 微升的数字滴定 PCR（ddPCR）样品混合液。然后，通过涡旋振荡充分混匀反应体系。

使用50微升多通道移液器，将20微升ddPCR样品混合液加入芯片的中间排孔中。然后，使用200微升多通道移液器，向底部排孔加入70微升油相，整个移液过程中避免产生气泡。

放置垫圈时，仅触碰边缘，避免接触中心凹陷区域，然后将板牢固地放入液滴生成仪中，并关闭盖子以开始运行。

使用多通道移液器，以30至45度的角度吸取试剂盒顶行中的浸润混合液，吸取40微升液体样本，持续3至5秒。然后，在45度角度下缓慢将混合液排入孔板中，持续超过3秒，使液体从孔壁侧边滴落，随后将移液器按至第二档，彻底排空液体。使用铝箔热封膜，在180摄氏度条件下对孔板密封5秒。

将密封的反应板放入热循环仪中，并按照NHEJ Drop-Off实验指南设置PCR反应条件：95摄氏度预变性10分钟；随后设置40个循环，每个循环包括94摄氏度变性30秒、55摄氏度退火1分钟、60摄氏度延伸2分钟。

经过40个循环后，在98摄氏度下保持10分钟，最后在4摄氏度下保存。所有步骤的升温速率为每秒2摄氏度。退火温度将根据所用探针或引物的不同而变化。将反应板牢固地放入液滴读数仪中，确保A1标记的孔位于左上角。

打开程序，通过为每个孔指定FAM为已知参考通道、HEX为未知通道来设置反应板。然后，更改每个样本的名称。运行液滴读取实验，进行直接定量，同时保存模板。