梯度聚合酶链式反应确定最佳退火温度

梯度聚合酶链式反应是一种用于优化引物（序列特异性的单链DNA）与模板DNA上互补位点结合时的退火温度的技术。

取含有正向和反向引物、dNTPs 以及耐热 DNA 聚合酶的混合物，并将其置于适当的缓冲液中。加入模板 DNA，然后将各组分转移至 PCR 板中。

将培养皿放入配备专用加热块的梯度热循环仪中。该设置可在55 °C至65 °C范围内建立线性退火温度梯度，并在整个培养皿上实现温度的均匀递增。

该反应将反应板加热至高温，使双链DNA变性为单链，并激活DNA聚合酶。随后，根据每个孔的程序设定值降低温度，促进引物退火。

在低于最佳退火温度时，引物会非特异性地结合到变性的DNA上，导致PCR反应中发生非特异性扩增。在高于最佳温度时，引物与DNA结合的数量则不足。

在最佳温度下，引物特异性地结合到目标DNA上。随后温度略有升高，使聚合酶利用dNTPs延伸引物。反复进行的变性、退火和延伸循环可实现DNA扩增。

分析每个孔中的产物。退火温度非最佳的孔会出现较少或非特异性扩增。

最佳退火温度可实现DNA的最大特异性扩增。

进行梯度 PCR 时，首先制备主混合液。然后，在 96 孔板中取出 19 微升主混合液作为无模板对照（NTC）。接着，将模板加入剩余的主混合液中。将 20 微升样品混合液分装至 96 孔板中。按照循环参数进行 PCR 扩增，然后根据文中所述参数生成熔解曲线图谱。