用于同时定量双遗传标记物的双重数字 PCR

0 次观看8:45 分钟 • July 8th, 2025

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双链数字聚合酶链反应 (ddPCR) 允许同时定量检测两种不同的遗传标记。

首先,取一个包含两个不同靶序列的样品。加入含有耐热 DNA 聚合酶、dNTP 和靶标特异性引物的混合物。接下来,添加两种不同的靶标特异性寡核苷酸探针,用荧光报告基因和猝灭剂分子标记以检测扩增的靶标。

溶液

用油乳化,将目标序列分配成许多纳米液滴。每个含有靶标的液滴都充当单独的反应容器。

开始单个纳米液滴内部扩增反应的热循环过程。

在高变性温度下,双链靶标分离成单链。

降低温度以达到适当的退火温度,使引物和寡核苷酸探针与模板结合。

猝灭剂的接近抑制了报告基因的荧光。在延伸温度下,DNA 聚合酶延伸引物并切割寡核苷酸探针。未结合的报告器发出荧光。

液滴通过液滴读取器(荧光检测系统)。检测到单荧光或双荧光表明阳性液滴含有靶标,而没有信号表明阴性液滴。

正液滴与分区总数的比率决定了目标序列的初始浓度。

要开始此过程,首先,在分子级水中为所有引物制备每升 100 微摩尔的储备浓度,并在 TE pH 8 缓冲液中为探针,如协议文本中所述。接下来,通过混合适量的数字PCR混合物,正向和反向引物,荧光探针和无核酸酶水来制备预混液。上下移液至少 10 次以混合,同时注意不要在溶液中引入气泡。

由于 dPCR 预混液比传统的 qPCR 预混液更粘稠,因此有必要使用移液混合技术以创建均匀的溶液。这允许在下游进行准确的 dPCR 定量。

要制作用于产生液滴的测定混合物,用于一式两份的运行样品,请将 36 微升预混液移液到常规 PCR 板中。对于每个 36 微升预混液,混合 12 微升 DNA 模板,将相应的重复孔留空在板上。包括阳性对照以确保测定正常运行。包括无模板对照或 NTC,以确保板内没有污染,并在以后设置荧光基线以进行数据分析。

在设置液滴发生器之前,使用多通道移液器将混合物上下移液约 15 次,以混合测定混合物。确保移液器吸头留在液体中,以避免在混合物中产生过多的气泡。

接下来,将包含八个孔的滤芯 1 插入白色滤芯支架,然后单击关闭滤芯支架。墨盒一现在已牢固就位,在产生液滴时无法从支架上脱落。

使用多通道移液器,将 20 微升测定混合物轻轻转移到标有"样品"的滤芯的中间位置,而不会引入气泡。将 70 微升液滴生成油移液到标有"油"的墨盒左侧。

用垫圈盖住墨盒,确保垫圈平坦,并由四个刻度均匀地固定在墨盒边缘。按下液滴发生器上的绿灯按钮打开门并放置墨盒。再次按下按钮关闭发电机。一旦门关闭,绿色按钮就会变暗,门无法重新打开。

液滴生成将立即开始并持续约 1 分钟。

在液滴生成过程中,将墨盒 2 放入第二个白色墨盒支架中,并以与墨盒 1 相同的方式进行制备。液滴生成完成后,昏暗的按钮将变为绿色。

打开液滴发生器门。取下装有墨盒一的白色墨盒支架并将其放在一边。将墨盒二放入液滴发生器中。

从墨盒一中取出垫圈并丢弃。请勿松开白色墨盒支架,因为该作可能会破坏新生成的液滴。

使用设置为 40 微升的多通道移液器,将吸头以 45 度角插入标有液滴的墨盒的第三列,然后慢慢移液所有液滴。通过将移液器吸头靠在孔壁上大约一半并缓慢排出液滴,将它们转移到最终的 PCR 板上。

同样,当小柱二的液滴生成完成后,从小柱二中取出垫圈,并将产生的液滴转移到最终的PCR板上。在板顶部放置一个可穿孔的铝箔盖,并将其放在板封口机上。将封口机设置为 180 摄氏度。按封口机上的"播放"并密封 10 秒钟。

要开始此过程,请将密封的最终 PCR 板放入热循环仪中。使用与最终PCR板兼容且升温速度为每秒2摄氏度的热循环仪。

运行以下热程序:在 95 摄氏度下运行 10 分钟,然后在 94 摄氏度下进行 40 次循环,每轮 30 秒,在 60 摄氏度下运行 60 秒,然后在 98 摄氏度下保持 10 分钟。循环完成后,将板转移到液滴读取器上,以自动测量每个孔中每个液滴中的荧光。

继续读取液滴之前,请确保液滴处于室温。首先打开随附的软件来设置液滴读数。在包含空 96 孔板原理图的默认"设置"菜单中,双击孔 A1 以打开包含三个部分的菜单 - "样品"、"检测 1"和"检测 2"。

在示例部分中,在标有"名称"的框中键入示例 ID,然后选中右侧标有"应用"的框。接下来,单击标有"实验"的下拉菜单。选择"红色"进行罕见事件检测,然后单击"Enter"。

移动

到标有"A1"的部分。在"名称"部分,填写检测并单击"输入"。在下面标有"类型"的框中,单击下拉菜单,选择"通道 1 未知",然后单击"输入"。

至标有"A2"的部分。在"名称"部分,填写检测结果并单击"Enter"。在下面标有"类型"的框中,单击下拉菜单,选择"通道 2 未知",然后单击"Enter"。

前面步骤中的所有信息现在都出现在井 A1 中。

命名所有包含液滴的后续孔。要节省总设置时间,请单击"Shift""Control"以同时选择多个孔。当印版的数字描述反映物理印版时,按菜单右下角的"确定"。在板原理图顶部出现的新菜单中,在"模板"部分下,选择"另存为"并命名并保存板。

屏幕左侧,单击"运行"并在弹出的"运行选项"窗口中选择适当的染料集。数据收集将启动并在软件中实时显示。

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最后更新:18 七月 2026