双重数字PCR同时定量双基因标志物

双通道数字聚合酶链式反应（ddPCR）可实现对两个不同遗传标志物的同步定量检测。

首先，取一个含有两种不同目标序列的样本。加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs以及目标特异性引物的混合物。接着，加入两种不同的目标特异性寡核苷酸探针，这些探针标记有荧光报告分子和淬灭分子，用于检测扩增的目标序列。

将溶液与油混合乳化，使目标序列分配到大量纳米液滴中。每个含有目标序列的液滴均作为一个独立的反应容器。

启动单个纳米液滴内扩增反应的热循环过程。

在较高的变性温度下，双链目标片段会分离成单链。

降低温度至适当的退火温度，使引物和寡核苷酸探针与模板结合。

淬灭基团的靠近会抑制报告基团的荧光。在延伸温度下，DNA聚合酶延伸引物并切割寡核苷酸探针。游离的报告基团发出荧光。

将液滴通过液滴读取仪——一种荧光检测系统。单重或双重荧光的检测信号表明液滴为阳性，含有目标物；而无信号则表明液滴为阴性。

阳性液滴数与总分区数的比值决定了目标序列的初始浓度。

开始此实验步骤时，首先根据方案文本中的描述，用分子级水配制所有引物的100 µmol/L储存液，用pH 8的TE缓冲液配制探针的100 µmol/L储存液。接着，通过混合适量的数字PCR混合液、正向和反向引物、荧光探针以及无核酸酶水，配制主混合液。轻轻反复吹打至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。

由于dPCR预混液比常规qPCR预混液更粘稠，因此必须使用移液吹打混匀技术以形成均一溶液。这有助于后续dPCR定量的准确性。

为进行样本的双份检测并制备用于液滴生成的反应混合液，用移液器将36 µL主混合液加入标准PCR板中。向每份36 µL的主混合液中加入12 µL的DNA模板，并在板上相应位置保留对应的重复孔为空。需包含阳性对照，以确保检测正常运行；同时需设置无模板对照（NTC），以确保板内无污染，并为后续数据分析设定荧光本底基线。

在设置液滴生成装置之前，使用多通道移液器将检测试剂混合物上下吹打约15次以充分混匀。操作时应确保移液器吸头始终浸没在液体中，以避免在混合物中产生过多气泡。

接下来，将含有八个孔的1号卡盒插入白色卡盒架中，并扣紧卡盒架。此时1号卡盒已牢固就位，在生成液滴过程中不会从架中脱落。

使用多通道移液器，轻轻将 20 微升的检测混合液转移至芯片上标记为 “样品” 的中间位置，注意避免引入气泡。向芯片左侧标记为 “油相” 的位置加入 70 微升液滴生成油。

用垫圈盖住滤芯，确保垫圈平整，并被滤芯边缘附近的四个卡扣均匀固定。按下液滴生成仪上亮起的绿色按钮以打开门，放入滤芯。再次按下按钮关闭生成仪。门关闭后，绿色按钮将变暗，此时门无法重新打开。

液滴生成将立即开始，并持续约1分钟。

在进行液滴生成的同时，将第二个 cartridge 置于另一个白色 cartridge 持架中，并以与第一个 cartridge 相同的