双重数字PCR同时定量双基因标志物

双通道数字聚合酶链式反应（ddPCR）可实现对两个不同遗传标志物的同步定量检测。

首先，取一个含有两种不同目标序列的样本。加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs以及目标特异性引物的混合物。接着，加入两种不同的目标特异性寡核苷酸探针，这些探针标记有荧光报告分子和淬灭分子，用于检测扩增的目标序列。

将溶液与油混合乳化，使目标序列分配到大量纳米液滴中。每个含有目标序列的液滴均作为一个独立的反应容器。

启动单个纳米液滴内扩增反应的热循环过程。

在较高的变性温度下，双链目标片段会分离成单链。

降低温度至适当的退火温度，使引物和寡核苷酸探针与模板结合。

淬灭基团的靠近会抑制报告基团的荧光。在延伸温度下，DNA聚合酶延伸引物并切割寡核苷酸探针。游离的报告基团发出荧光。

将液滴通过液滴读取仪——一种荧光检测系统。单重或双重荧光的检测信号表明液滴为阳性，含有目标物；而无信号则表明液滴为阴性。

阳性液滴数与总分区数的比值决定了目标序列的初始浓度。

开始此实验步骤时，首先根据方案文本中的描述，用分子级水配制所有引物的100 µmol/L储存液，用pH 8的TE缓冲液配制探针的100 µmol/L储存液。接着，通过混合适量的数字PCR混合液、正向和反向引物、荧光探针以及无核酸酶水，配制主混合液。轻轻反复吹打至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。

由于dPCR预混液比常规qPCR预混液更粘稠，因此必须使用移液吹打混匀技术以形成均一溶液。这有助于后续dPCR定量的准确性。

为进行样本的双份检测并制备用于液滴生成的反应混合液，用移液器将36 µL主混合液加入标准PCR板中。向每份36 µL的主混合液中加入12 µL的DNA模板，并在板上相应位置保留对应的重复孔为空。需包含阳性对照，以确保检测正常运行；同时需设置无模板对照（NTC），以确保板内无污染，并为后续数据分析设定荧光本底基线。

在设置液滴生成装置之前，使用多通道移液器将检测试剂混合物上下吹打约15次以充分混匀。操作时应确保移液器吸头始终浸没在液体中，以避免在混合物中产生过多气泡。

接下来，将含有八个孔的1号卡盒插入白色卡盒架中，并扣紧卡盒架。此时1号卡盒已牢固就位，在生成液滴过程中不会从架中脱落。

使用多通道移液器，轻轻将 20 微升的检测混合液转移至芯片上标记为 “样品” 的中间位置，注意避免引入气泡。向芯片左侧标记为 “油相” 的位置加入 70 微升液滴生成油。

用垫圈盖住滤芯，确保垫圈平整，并被滤芯边缘附近的四个卡扣均匀固定。按下液滴生成仪上亮起的绿色按钮以打开门，放入滤芯。再次按下按钮关闭生成仪。门关闭后，绿色按钮将变暗，此时门无法重新打开。

液滴生成将立即开始，并持续约1分钟。

在进行液滴生成的同时，将第二个 cartridge 置于另一个白色 cartridge 持架中，并以与第一个 cartridge 相同的方式进行准备。当液滴生成完成后，微亮的按钮将变为绿色。

打开液滴生成器门。取出装有1号芯片的白色芯片架并放在一旁。将2号芯片放入液滴生成器中。

从第一个 cartridge 中取下垫圈并丢弃。不要松开白色的 cartridge 固定器，因为该操作可能会破坏新生成的液滴。

使用设定为 40 微升的多通道移液器，将吸头以 45 度角插入芯片上标记为“液滴”的第三列，缓慢吸取所有液滴。转移至最终的 PCR 板时，将移液器吸头抵住孔壁约一半深度处，缓慢排出液滴。

同样，当第二个芯片的液滴生成完成后，取下第二个芯片的垫圈，将生成的液滴转移至最终的PCR板中。在板上覆盖可穿刺的铝箔膜，并将板放入板封仪中。将封板仪温度设置为180摄氏度，按下封板仪上的“播放”按钮，封板10秒。

开始此操作时，将密封的最终PCR板放入热循环仪中。使用与最终PCR板兼容且升温速率为每秒2摄氏度的热循环仪。

运行以下热循环程序：95 °C 下持续 10 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 下 30 秒和 60 °C 下 60 秒，最后在 98 °C 下维持 10 分钟。循环完成后，将板转移至液滴读取仪，自动测量每个孔中每个液滴的荧光信号。

确保液滴在室温下后再进行液滴读取。首先打开配套软件以设置液滴读取程序。在默认 设置 包含空白96孔板示意图的菜单，双击A1孔以打开包含三个部分的菜单—— 样品， 检测 1," 和 检测 2."

在样本区域，将样本编号输入标有“名称”的框中，并勾选右侧标记为“应用”的复选框。接着，点击标有“实验”的下拉菜单，选择“RED”（即稀有事件检测），然后点击“确定”。

转至标记为 “A1” 的区域。在 “名称” 区域中填写检测项目，然后点击 “回车”。在下方标有 “类型” 的框中，点击下拉菜单，选择 “通道 1 未知样本”，然后点击 “回车”。

转至标记为 “A2” 的部分。在 “名称” 部分填写检测项目，然后点击 “回车”。在下方标有 “类型” 的框中，点击下拉菜单，选择 “通道 2 未知”，然后点击 “回车”。

之前所有步骤的信息现在均已存在于 A1 孔中。

为所有后续含有液滴的孔命名。为节省总设置时间，可按住 “Shift” 或 “Control” 键以同时选择多个孔。当平板的数字图像与实际平板一致时，点击菜单右下角的 “OK”。在平板示意图顶部出现的新菜单中，在 “Template” 区域下选择 “Save As”，并为该平板命名并保存。

在屏幕左侧，单击“运行”，然后在弹出的“运行 选项”窗口中选择合适的染料组。数据采集将随即开始，并在软件中实时显示。