实时定量反转录聚合酶链式反应诊断病毒感染

实时定量反转录 PCR 可用于鉴定病毒感染。

从含有目标病毒RNA的样本开始。加入靶标特异性的引物——用于辅助DNA合成与扩增，同时加入逆转录酶和dNTPs。

加入耐热DNA聚合酶——一种用于在PCR循环中扩增DNA的酶——以及SYBR Green——一种可插入双链DNA（dsDNA）的染料。将反应体系放入热循环仪中。设置适合引物结合目标RNA的温度。

逆转录酶在添加脱氧核苷三磷酸（dNTPs）到引物上的同时，切割模板RNA，合成互补DNA（cDNA）。

升高温度，使反转录酶失活。降低温度，使引物与cDNA结合，为后续扩增做准备。再升高温度进入延伸阶段，DNA聚合酶在此阶段延伸引物，合成双链DNA（dsDNA）。

连续的循环导致双链DNA呈指数级扩增。SYBR Green结合到DNA上的数量逐渐增加，引起荧光发射信号成比例增强。绘制各循环中检测到的荧光信号。

阳性扩增曲线表明样本中存在病毒RNA。

逐步升高温度至熔解温度，使双链DNA变性为单链。结合的染料分子随之释放，荧光随之消失。将荧光信号的降低值对温度作图。

出现对应于病毒特异性熔解温度的峰表明存在病毒感染。

使用电子表格规划 PCR 板的布局，同时考虑测试样本和对照样本。通过消毒工作台面来准备 PCR 工作站；若使用紫外柜，请在开始前 10 分钟打开紫外灯。

从冷冻箱中取出试剂和引物进行解冻，但酶混合物需始终置于冰上。混合试剂后短暂离心以收集液体。根据文稿说明，分别配制针对狂犬病病毒属（lyssavirus）和β-肌动蛋白（beta-actin）的PCR预混液。配制完成后将预混液置于冰上，待用。使用前再次混匀并短暂离心，然后将19微升（µL）分装至与PCR仪兼容的反应板或管条的相应孔中。

在另一个房间或紫外柜中，小心加入 1 微升制备好的 RNA。如果使用紫外柜，应在开始前 10 分钟打开紫外灯。在加入测试样品后，再加入阳性对照和无模板对照。

将RNA加入到主混合液时，确保将其添加至正确的孔中。可使用板图辅助完成此步骤。

密封反应板，检查盖子是否平整覆盖整个反应板，并离心以使所有液体聚集于各孔底部。确保每个孔中的液体体积相同，且无可见气泡。随后，将样品转移至PCR仪中。

打开程序，选择'SYBR Green' 并启用'Dissociation'。选择需要分析的孔，将样本类型设为"Unknown"，荧光染料设为"SYBR"。在板布局上用样本信息标记各孔，包括该检测是用于Lyssavirus孔还是beta-actin孔。

单击“热循环程序设置”，并根据论文中所述修改热循环条件。单击“开始”，然后选择文件保存位置，并勾选运行结束后关闭光源的选项。当出现可在光源预热完成前开始运行的提示时，单击“立即运行”，但需确保光源剩余预热时间少于15分钟。