微球聚合酶链式反应扩增单链DNA

微球PCR利用表面偶联有寡核苷酸的微米级小球，可实现单链DNA的优先扩增。

开始微球PCR时，取含有模板单链DNA链、带有额外核苷酸标签的正向引物、耐热DNA聚合酶、dNTPs以及展示有单链寡核苷酸探针的微球的反应混合物。

将试管放入热循环仪中，并按照设定的条件运行。

在第一个循环中，在退火温度下，模板DNA与微球表面的探针结合，使得模板DNA作为正义链发挥作用。在延伸过程中，聚合酶延伸DNA，双链仍与微球保持连接。

在下一个循环的变性过程中，模板DNA从微球上分离，而探针链仍结合在表面——作为新链合成的模板。

在退火过程中，带有标签的引物与反义链结合。随后，聚合酶将其延伸，以合成带有核苷酸标签的有义链。

重复该循环数次，以生成多份有义单链DNA，这些DNA进入溶液中，而双链污染物则保持结合状态。

将PCR产物转移至含有上样缓冲液的离心管中。将产物和分子量标记物分别加入凝胶的不同加样孔，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。

模板DNA形成一条微弱的低分子量条带，而一条明显的高分子量条带则证实了单链DNA的扩增。

使用40倍光学显微镜通过显微计数获得约25个微球。随后，按照文本方案所述混合所有试剂。将样品放入热循环仪中，并在适当条件下开始不对称PCR反应。

在对称PCR后收集上清液是最关键的步骤之一，因为这是利用微球生成单链DNA的主要过程。

扩增后，向每个样本中加入八微升6X上样缓冲液。将每个样本的15微升上样至2%琼脂糖凝胶中。然后，在1X TAE缓冲液中以100伏电压进行电泳35分钟。