0 次观看 • 4:39 分钟 • July 8th, 2025
定量点印迹（QDB）是一种用于测定样品中目标蛋白浓度的有用技术。当样品被固定在聚合物膜上后，即可对蛋白质进行检测 通过 免疫印迹
首先，取一块QDB板——一种在每个孔底部附有硝酸纤维素膜的多孔板。将含有目标蛋白的组织裂解液样本加至膜孔中央。
让样品自然干燥。目标蛋白会结合到膜上。 通过 非共价相互作用
加入封闭液。封闭液中的蛋白质会结合到膜上未结合的位点，防止检测试剂发生非特异性结合。
接下来，加入含有可与样本中目标蛋白结合的一抗的溶液。洗涤以去除未结合的一抗。
然后加入二抗溶液。这些分子带有过氧化物酶标记，可与结合在蛋白质上的初抗结合。洗涤以去除未结合的抗体。
最后，加入含有化学发光底物和过氧化氢的溶液。利用过氧化氢，抗体结合的过氧化物酶氧化底物并发出光。使用酶标仪测量样品的发光强度。
使用已知浓度的目标蛋白进行连续稀释，生成标准发光曲线。将样品测得的发光值绘制在曲线上，以确定目标蛋白的浓度。
在此步骤中，将一个空的移液枪头盒置于QDB板下方，以避免板的底部接触台面。向QDB板中单个单元底部的膜中心加入最多2微升样品。
在加样过程中，切勿让QDB板的底部接触任何表面，且不要向单个孔中加入过多样品。每个孔的加样量不应超过4 µL。
接下来，将加样后的QDB板在室温下放置一小时，或在通风良好的环境中于37摄氏度孵育十五分钟。为封闭该板，将QDB板浸入转移缓冲液中，并轻轻振荡10秒钟。
随后，用 TBST 轻轻冲洗 QDB 板三次，然后在持续振荡条件下用 TBST 洗涤 5 分钟。接着，在持续振荡条件下，用封闭缓冲液封闭 QDB 板 1 小时。现在，将一抗用封闭缓冲液按选定浓度稀释，并向普通 96 孔板的每个单独孔中加入 100 µL。
将QDB板插入96孔板中，然后将组合板在室温下振荡孵育两小时，或在4摄氏度下振荡过夜。随后，用TBST轻轻冲洗该板三次，再用TBST洗涤三次，每次在持续振荡条件下孵育五分钟。
接下来，将二抗用封闭缓冲液稀释至选定浓度，并将100 µL分装至96孔板的每个孔中。然后，将QDB板放入已加样的96孔板内，在室温下持续振荡孵育1小时。用TBST轻轻冲洗QDB板3次，随后在持续振荡条件下，用TBST洗涤3次，每次5分钟。
为了定量，准备ECL底物并分装到96孔板中，每孔100微升。然后将QDB板插入96孔板中，在持续振荡条件下孵育两分钟。之后将QDB板从96孔板中取出，并轻轻振摇以去除多余液体。随后将板置于白色微孔板上。接下来，打开酶标仪，在用户界面中选择带盖板模式，然后将组合好的板放入酶标仪中进行定量。