定量 Western 印迹法检测蛋白质表达水平

定量蛋白质印迹法——一种基于总蛋白归一化的技术——可用于定量目标蛋白的表达水平。

首先，将组织裂解液加入聚丙烯酰胺梯度凝胶的加样孔中。裂解液中含有目标蛋白以及其他细胞蛋白。

以适当的电压电泳，使样品蛋白在梯度凝胶中实现分离。电泳完成后，将凝胶置于转膜夹心结构的聚合物膜上方。

施加电流将分离的蛋白质转移到膜上。随后将膜放入荧光总蛋白染料中，染料中的带电分子通过静电作用与膜上所有蛋白质结合。

加入封闭液。溶液中的蛋白质会结合到膜上，从而防止检测试剂发生非特异性结合。加入仅与目标蛋白结合的一抗。然后，加入带有荧光染料标记的二抗，该二抗可结合于一抗。

使用激光激发样品。在相应波长下记录总蛋白染料和抗体结合的荧光染料分子发射的荧光。

为计算归一化的蛋白上样量值，将每条泳道的总蛋白信号除以其中的最大值。将目标蛋白信号除以相应的归一化上样量值，以确定目标蛋白的相对表达水平。

进行电泳时，将预制的4至12% Bis-Tris梯度胶安装在凝胶电泳装置系统中，并在加样孔中加入3.5 µL蛋白标准品。若使用内参标准进行膜间归一化，请将与其他样品等量的样品加入蛋白标准品旁边的前三个加样孔中，其余加样孔每孔加入30 µg样品。随后，先以80 V电压运行堆积胶10分钟，再以150 V电压继续电泳45至60分钟。

电泳结束后，开始组装转印夹心结构：将蛋白胶置于底部支架上，其上依次放置聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）和滤纸。使用转印滚轮去除所有气泡，然后将上层支架放在滤纸上方，再次滚动整个夹心结构以彻底去除气泡。

将整个凝胶夹心结构转移至转印装置中，电极置于装置左侧，并将凝胶海绵放置在夹心结构顶部，使海绵与装置上相应的电接触点对齐。

关闭盖子后，选择并启动相应的程序。程序结束后，将膜裁剪至与凝胶相同大小，并用双蒸水快速清洗裁剪好的膜，随后继续进行总蛋白染色。

进行总蛋白染色时，将膜卷成蛋白面朝内的50毫升离心管中，在通风橱内加入5毫升蛋白染色液，于室温下在摇床上孵育5分钟。

孵育结束后，用5毫升洗涤液快速洗涤膜，在每次洗涤间隙将管短暂放回滚轴仪上，随后用超纯水短暂漂洗。向膜上加入3毫米封闭缓冲液，并将膜置于滚轴仪上室温孵育30分钟。弃去封闭缓冲液，加入已优化浓度的特异性一抗，于4摄氏度在滚轴仪上孵育过夜。

第二天，在室温下用滚轴装置，每次加入5毫升新鲜PBS，共洗涤膜6次，每次5分钟。最后一次洗涤后，将膜置于滚轴装置上，加入相应的二抗溶液，室温孵育1小时，随后进行3次洗涤，每次30分钟。最后一次洗涤后，将膜干燥，并用铝箔包裹以避光保存。

进行图像采集时，将膜的蛋白质面朝下放置在扫描仪上，并在软件中选择扫描区域。然后在两个通道中采集图像，并将图像导出至合适的图像分析程序。

显示 700 纳米通道以展示总蛋白染色结果，选择“分析”并绘制一个矩形以定义用于归一化的感兴趣区域。然后，将第一个矩形区域复制并粘贴到每个单独的样本上，以确保所有被分析泳道的定义区域大小一致。

为量化每条泳道中的蛋白质浓度，将总蛋白染色和目的蛋白的结果复制到电子表格程序中，并确定最高的总蛋白染色信号值。然后将每个总蛋白染色信号值除以该最大值，得到归一化的蛋白上样量；再将每个样本的800纳米信号值除以其对应的归一化蛋白值，以计算不同样本中相对蛋白质表达比率。