0 次观看 • 4:43 分钟 • July 8th, 2025
炎症部位包含多种免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞和白细胞。
为了通过单细胞 Western 印迹法鉴定异质性细胞群体，取一块预先水化的印迹芯片，该芯片由光活化聚丙烯酰胺凝胶构成，并被制备成多个区块阵列。每个区块包含大量微孔。将凝胶设计为多个区块可实现多个细胞的并行捕获。
加入含有异质细胞群体的悬液。孔的尺寸允许单个细胞沉降。将芯片浸入装有适当缓冲液的电泳槽中。缓冲液中的去垢剂分子会破坏细胞膜，释放细胞内容物。
施加电场。释放的蛋白质在凝胶中迁移，分离成不同大小的条带。用洗涤缓冲液清洗芯片，去除非特异性结合的分子，仅保留细胞蛋白质，包括目标标志物蛋白质。
将凝胶暴露于紫外光下，以激活其表面并固定蛋白质。
加入针对每种细胞类型特异性标志蛋白的一抗抗体混合物，形成蛋白-一抗抗体复合物。加入荧光标记的二抗抗体混合物，二抗抗体与其对应的一抗抗体结合，从而标记相应的细胞特异性标志蛋白。
将芯片放入扫描仪中。测量荧光强度，该强度与样品细胞悬液中单个细胞对应蛋白标志物的表达水平成正比。
进行单细胞 Western 印迹分析时，将 1 毫升稀释后的单细胞悬液加入已水化的单细胞 Western 印迹芯片中，芯片置于 10 厘米培养皿底部。5 至 15 分钟后，在明场显微镜下观察芯片。约 15% 至 20% 的微孔应含有单个细胞，而含有两个或更多细胞的微孔应少于 2%。
如果芯片已正确加载，则将培养皿倾斜45度，用悬浮缓冲液洗涤芯片三次，以去除未被捕获的细胞。最后一次洗涤后，小心地将芯片正面朝上装入单细胞Western仪的电泳槽中，并用裂解/电泳缓冲液完全覆盖整个单细胞Western印迹芯片。根据相应的实验参数启动细胞裂解并运行仪器。
运行结束后，在室温下用新鲜的洗涤缓冲液进行两次冲洗，每次冲洗10分钟。第二次冲洗后，向抗体孵育室中加入80微升目标一抗溶液，并将芯片凝胶面朝下放置，使抗体溶液沿芯片毛细扩散。
室温孵育两小时后，在摇床上用洗涤缓冲液洗涤芯片三次，再用水洗涤一次。在避光条件下，室温下用适当的二抗孵育芯片一小时。孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤芯片三次，并将芯片置于载片离心机上离心，以去除残留的洗涤缓冲液。
为了剥离单细胞 Western 杂交芯片，将一个 50 毫升的试管架放入 60 摄氏度的水浴中，使水面刚好高出试管架 1 厘米。在通风橱内，向一个容器中加入 40 毫升剥离缓冲液和 320 微升 β-巯基乙醇。将芯片放入容器内的 10 厘米培养皿中，并用封口膜密封容器。
然后，将罐体放入水浴中的试管架内。90分钟后，小心地将芯片转移至新的培养皿中，并用洗涤缓冲液短暂清洗芯片一次，随后向培养皿中加入15毫升新鲜洗涤缓冲液，在摇床中洗涤15分钟。