利用Southern印迹法检测小鼠胚胎干细胞基因组中的同源重组

Southern印迹技术涉及从复杂的DNA混合物中鉴定特定的DNA序列 通过 基于探针的检测

为了通过Southern印迹法在小鼠胚胎干细胞中鉴定同源重组（HR）事件，需从细胞中提取基因组DNA。用限制性内切酶孵育，将DNA消化成较小的片段。

将DNA加样到琼脂糖凝胶上。通过电泳实现基于大小的片段分离。

用酸性溶液处理凝胶以去除嘌呤碱基，使双链DNA（dsDNA）结构松散。加入碱性变性溶液，高pH值会破坏氢键，将已松散的双链DNA变性为单链DNA（ssDNA）。用中和溶液孵育，以中和凝胶的pH值。

使用印迹纸、尼龙膜和叠放在膜上的凝胶组装转印系统。进行转印。单链DNA从凝胶转移至膜上 通过 毛细作用向下进行

用紫外线照射膜，使DNA交联并固定。将膜放入含有杂交溶液的管中。在旋转条件下孵育，使膜充分浸润并防止探针非特异性结合。

最后，将膜与含有单链放射性标记探针的杂交缓冲液共同孵育。探针会结合到特定的DNA区域。 通过 序列互补性

洗涤膜以去除未结合的探针。将膜暴露于X射线。膜上出现的明显条带可将含有同源重组（HR）事件的DNA区域与对照区域区分开来。

对于每份基因组DNA，将30微升Dra I 10X缓冲液、3微升Dra I酶和10微克基因组DNA加入每个样本中。加水至终体积为30微升，于37摄氏度孵育过夜，以消化基因组DNA。

制备含溴化乙锭的1%琼脂糖电泳凝胶。将先前获得的样品与1 Kb DNA标记物一同上样至凝胶中，在30至40伏电压下过夜电泳。次日，将凝胶浸入含有0.2 N盐酸溶液的托盘中，在室温下用摇床轻轻振荡20分钟。

将凝胶转移至含有DNA变性溶液的托盘中，在室温下轻轻振荡20分钟。然后将凝胶转移至含有DNA中和溶液的托盘中，在室温下轻轻振荡20分钟。使用快速向下转移系统，将DNA从凝胶转移至膜上。

接下来，按照制造商提供的说明组装TurboBlotter和印迹叠层。然后取出膜，用2倍浓度的氯化钠-柠檬酸钠溶液洗涤一分钟。用纸巾吸去液体，随后使用紫外交联仪将DNA与膜进行交联。

开始用放射性物质标记DNA探针时，将热变性的探针DNA加入含有即用型DNA标记微珠的离心管中。用移液器吹打混匀，再加入5 µL放射性标记的脱氧胞苷三磷酸（deoxycytosine triphosphate）。在37°C下孵育15分钟。根据制造商提供的说明，使用G-50微柱纯化标记后的探针。用液体闪烁计数器测定放射性活性。

开始将膜与标记探针杂交时，将膜放入杂交管中，加入混合好的预杂交溶液。将杂交管置于杂交炉中，在42摄氏度下预杂交30分钟。

然后，将试管从烘箱中取出，将预杂交液倒入一个50毫升的试管中。加入变性的探针并轻轻混匀。将混合好的杂交液加入杂交管中，再将试管放回杂交烘箱。随后，让杂交反应过夜进行。

为了去除未杂交的探针，将膜放入含有1×柠檬酸钠-氯化钠溶液（含