0 次观看 • 8:51 分钟 • July 8th, 2025
microRNA（miRNA）是小的单链非编码RNA。miRNA会结合到多蛋白复合物中，并进一步与互补的靶mRNA序列结合，从而负向调控基因表达。
为了从植物组织的总RNA中检测特定的miRNA，需加入含有示踪染料和甲酰胺（一种RNA变性剂）的上样缓冲液。在进行电泳前，将样品加热以变性RNA，防止形成二级结构。
将样品和标准RNA标记物加入预组装的变性聚丙烯酰胺凝胶孔中。进行电泳，实现RNA片段的基于大小的分离。
将凝胶转移至电转印夹板中预先润湿的滤纸上。将经缓冲液浸泡的尼龙转印膜对齐覆盖在凝胶上，然后叠加预先润湿的滤纸。进行电转印。
电流促使带负电荷的RNA（包括miRNA）从凝胶中迁移至带正电荷的尼龙膜表面。将膜暴露于紫外光下，可使RNA与膜发生交联，从而防止RNA脱落。
将膜置于含有封闭剂的杂交缓冲液中孵育，以占据非特异性结合位点，降低背景噪声。
加入与目标 miRNA 互补的放射性标记 RNA 寡核苷酸探针，以特异性结合目标 miRNA。用缓冲液洗涤膜，去除未结合的探针。
使用磷屏成像系统检测并定量放射性杂交信号强度。高分辨率信号表明植物组织中miRNA的特异性表达。
停止凝胶的预电泳。
在上样前彻底清洗胶孔，以去除孔内残留的尿素沉淀。将重悬的RNA样本在98摄氏度加热1分钟。使用毛细管尖端趁热将样本加入胶孔中。避免引入气泡。
将所有样品完全上样并安装好盖子。以80伏电压电泳运行3小时，或直至溴酚蓝完全迁移。使用带正电荷的尼龙膜进行转膜。将膜裁剪至与玻璃板相同尺寸，并在其右上角做好标记。轻轻将膜放置于无菌Milli-Q水表面，确保标记面朝下，面向水面。
取一个洁净的托盘，准备用于电转印的凝胶三明治结构。将胶盒的灰色面朝下放置。倒入 1X TBE 缓冲液，液面略高于胶盒水平。用 1X TBE 预先浸湿纤维垫，并挤压以去除气泡。剪两块与纤维垫大小相同的转印滤纸。
用1X TBE预润湿一张滤纸，将其覆盖在纤维垫上。用塑料移液管在纸上滚动以去除气泡。再用1X TBE预润湿另一张滤纸，覆盖在盒式装置上。滚动去除气泡。此时，三明治结构已准备好进行电转印。
电泳完成后，停止电泳运行，打开装置盖子。从装置中取出电泳夹心盒，再从夹心盒中取出玻璃板。
小心地将凝胶从装置中取出。将其覆盖在印迹纸上，使第一个上样RNA样品朝向右侧。将预先浸泡的膜轻轻浸入1X TBE中，然后放置在凝胶上，确保标签面朝下。注意防止膜和凝胶变干。轻轻滚压以去除气泡。
将一张印迹纸浸入1X TBE中，然后铺在膜上，去除气泡。再覆盖一张印迹纸，并去除气泡。最后将纤维垫置于组件上方，完成三明治结构。用力合上暗盒。
将转印槽放入模块中。用 1× TBE 缓冲液（pH 8.2）加液至印迹标记线处。盖上仪器盖子，在 4 摄氏度或冷室中以 10 伏电压过夜转印。在电转印即将完成前，提前将紫外交联仪准备就绪，并设置为 1,200 能量单位。
转膜完成后，从模块中取出卡匣。将湿润的膜放置在A4纸上，确保标记面朝上。通过254纳米紫外光以120毫焦耳照射，使RNA交联至膜上。交联后的印迹可于4摄氏度保存，或直接用于杂交实验。
设计一条与待检测的小RNA完全互补的探针，并使用PNK酶在探针的5′端进行标记，然后按所示组合各组分。将反应混合物在37°C下孵育30分钟。
孵育30分钟后，使用G-25柱将未标记的探针从反应混合物中分离。为提高探针的标记效率，使用前预先准备G-25柱。将膜的RNA面朝上放入杂交瓶中。使用前充分混匀杂交缓冲液。加入10 ml杂交缓冲液，并将杂交瓶置于保持在35°C并旋转的杂交炉中。
进行20至30分钟的预杂交。预杂交结束后，将瓶子从烘箱中取出。轻轻将标记好的探针加入杂交缓冲液中，确保不要产生气泡。将膜在35°C烘箱中以旋转方式孵育12小时。
杂交后，从瓶中移除杂交缓冲液。使用洗涤缓冲液 I 对印迹进行快速洗涤。此步骤旨在去除印迹上残留的过量杂交溶液。随后，用洗涤缓冲液 I 在 35 摄氏度下孵育印迹 30 分钟。再用缓冲液 II 在 35 摄氏度下洗涤 30 分钟。
洗去印迹后，将其放入杂交膜封袋中，除去多余的缓冲液并封口。将膜放入暗盒中，与无放射性磷屏接触曝光12小时。使用Typhoon生物分子成像仪检测杂交信号，并用ImageJ软件分析结果。