荧光波动光谱研究蛋白质同源寡聚化

荧光波动光谱可以确定样品中蛋白质的寡聚状态。

首先，取含有荧光标记的蛋白质单体溶液的腔室载玻片。将载玻片放在共聚焦显微镜下。将激光束聚焦在样品的一小部分（共聚焦体积）上，以激发蛋白质单体。

由于布朗运动，蛋白质分子在共聚焦体积中扩散进出。这种运动导致荧光强度快速变化，导致荧光强度随时间波动。

添加二聚化剂——一种二价配体，有助于两个蛋白质单体结合，从而形成二聚体。由于二聚化，两个荧光标记物聚集在一起形成一个颗粒，从而增加了每个颗粒的荧光强度——分子亮度。

由于二聚化而导致的分子亮度增加增加了荧光波动的幅度——因为两个荧光标记一起进入和离开共聚焦体积。

获得添加二聚化剂前后随时间变化的共聚焦体积图像。

计算共聚焦图像中各个像素的亮度，并获得随时间变化的平均亮度曲线。

每个颗粒的双重荧光信号，添加二聚化剂导致亮度增加两倍，而蛋白质分子的总数保持不变——表明二聚体的形成。

要建立多孔板阵列，首先，在用于尺寸排阻色谱的相同缓冲液中制备 100 纳摩尔纯化的 FKBP12 溶液。以 13,000 RPM 的快速旋转进行超声处理和离心，以防止形成聚集体。

现在，将 100 至 200 微升稀释的蛋白质移液到带有玻璃底的 8 孔观察室中。将 BB 二聚化器加入至终浓度为 10、20、40、80、100、150、300 和 500 纳摩尔。作为参考，单独制备100纳摩尔mVenus的溶液，以评估潜在的聚集和沉淀效应，并在相同的采集设置下恢复单体的亮度值。

任何配备数字探测器或特征良好的模拟探测器的光学扫描显微镜共聚焦系统，并且能够为捕获的每个像素保持恒定的停留时间。选择专为荧光相关光谱设计的项圈校正水浸物镜。

现在在项圈校正水浸物镜中加入一滴水。将 8 孔观察室安装到载物台中。通过打开 514 纳米激光器并将其设置为物镜出口处的 20 至 100 纳瓦功率来设置激发光束路径。打开一个 HyD 检测器。能够进行光子计数的探测器是优选的。选择 520 至 560 纳米的发射窗口。

对于采集模式，请使用 16 x 16 像素。

设置像素停留时间，使帧时间长于蛋白质扩散，像素停留时间短得多。这对应于将本演示中使用的系统的停留时间设置为大约 13 微秒。

针孔设置为一个 Airy 单位，以实现大约 545 纳米的相应发射。选择 xy 时间采集模式，并选择每个采集和孔要采集的帧数。现在，将像素大小设置为大约 120 纳米。

如果系统配备高通量模式，请引入每口井的坐标，以及每口井的采集次数，以实现流程自动化。如果系统配备了灌注系统，则加载BB溶液，并将灌注编程为在第5,000帧之后立即开始，以评估二聚化动力学，同时获取10,000张图像。

选择正确的孔，并专注于解决方案。然后，开始采集并以 TIFF 格式保存生成的图像堆栈。