荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

荧光涨落光谱法可以确定样品中蛋白质的寡聚状态。

首先，取一个含有荧光标记蛋白单体溶液的带腔载玻片。将载玻片置于共聚焦显微镜下。将激光束聚焦于样品的微小区域——即共聚焦体积——以激发蛋白单体。

由于布朗运动，蛋白质分子在共聚焦体积内不断扩散进出。这种运动导致荧光强度发生快速变化，从而引起荧光强度随时间的波动。

加入二聚化试剂——一种二价配体，可促进两个蛋白质单体结合，从而形成二聚体。由于二聚化作用，两个荧光标记物聚集在一起形成一个单一颗粒，使每个颗粒的荧光强度增加，即分子亮度提高。

由于二聚化导致的分子亮度增加会提高荧光波动的幅度——因为两个荧光标记会同时进入和离开共聚焦体积。

在加入二聚化试剂前后，获取共聚焦体积随时间变化的图像。

计算共聚焦图像中各个像素的亮度，并获取随时间变化的平均亮度曲线。

二聚化试剂的加入使每个颗粒产生双重荧光信号，亮度因此提高两倍，而蛋白质分子总数保持不变，表明二聚体的形成。

为建立多孔板阵列，首先在用于尺寸排阻色谱的相同缓冲液中配制100纳摩尔纯化的FKBP12溶液。超声处理后，以13,000转/分钟短暂离心，以防止聚集物形成。

现在，将100至200微升稀释后的蛋白质溶液加入底部为玻璃的8孔观察室中。加入BB二聚化诱导剂，使其终浓度分别为10、20、40、80、100、150、300和500纳摩尔。作为对照，制备仅含100纳摩尔mVenus的溶液，用于评估可能的聚集和沉淀效应，并在相同的成像条件下获取单体的亮度值。

任何配备数字探测器或经过良好表征的模拟探测器，并能够对所获取的每个像素保持恒定停留时间的共聚焦激光扫描显微系统均可使用。请选择专为荧光相关光谱设计的校正环水浸物镜。

现在向封片校正水浸物镜滴加一滴水。将8孔观察室安装到显微镜载物台上。通过开启514纳米激光器，并将其在物镜出口处的功率设置为20至100纳瓦，来设定激发光路。打开一个HyD探测器，优先选用具备光子计数能力的探测器。选择520至560纳米的发射波长范围。

采集模式请选择 16 × 16 像素。

设置像素驻留时间，使得帧时间长于蛋白质扩散时间，而像素驻留时间远短于帧时间。在本演示所用系统中，这相当于将驻留时间设置为约13微秒。

将针孔设置为对应约545纳米发射波长的1个艾里单位。选择xy-时间采集模式，并设置每次采集每个孔所需的帧数。现在，将像素大小设置为约120纳米。

如果系统配备高通量模式，输入每个孔的坐标以及每孔采集的图像数量，以实现流程自动化。如果系统配备灌流装置，加载BB溶液，并设置灌流程序在第5,000帧后立即开始，以便在连续采集10,000张图像的同时评估二聚化动力学。

选择正确的孔位，并聚焦于溶液。然后开始采集，将获得的图像序列以TIFF格式保存。