基于荧光各向异性的蛋白质-蛋白质相互作用检测

对于基于各向异性的荧光各向异性蛋白质-蛋白质相互作用检测，首先在合适的各向异性缓冲液中用 C 端四半胱氨酸基序标记的重组靶蛋白。

添加含荧光团的染料 — 通过四半胱氨酸基序与靶蛋白结合。用各向异性缓冲液透析，去除未结合的染料。将混合物转移到石英比色皿中。测量吸光度，确定成功标记的靶蛋白的百分比。

在荧光比色皿中，将荧光团标记的靶蛋白与未标记的蛋白混合。使用荧光光谱仪测量荧光各向异性。

当目标蛋白质在缓冲液中自由悬浮时，由于布朗运动，附着在其上的荧光团绕其轴随机旋转。当用适当波长的垂直偏振光激发时，荧光团会发出垂直和水平面偏振的光。测量垂直和水平偏振发射的荧光强度之比（各向异性）。

当未标记的蛋白质与荧光团标记的靶标结合时，蛋白质复合物的分子大小增加，从而减少其旋转运动。结果，发射的光变得更加偏振，垂直面的发射高于水平面——增加了各向异性。

添加增加浓度的未标记蛋白质并重复各向异性测量。

未标记蛋白质添加量的增加，各向异性的非线性增加表明未标记的蛋白质在荧光团标记的靶蛋白上的多个不相同结合位点结合。

3 纳摩尔 SBDS-FlAsH 蛋白与 3 纳摩尔 Lumio Green 染料混合在 5 微升体积的各向异性缓冲液中。让反应在 4 摄氏度下进行 8 小时。8小时后，将样品与各向异性缓冲液透析过夜，以除去游离染料。使用石英比色皿在分光光度计中测量 280 纳米和 508 纳米处的吸光度。然后，使用朗伯-比尔定律量化文本方案中描述的标记蛋白质的百分比。

在测量各向异性值之前，应仔细进行蛋白质配体的每个滴定步骤，确保将整个样品分配到溶液中并变得均匀。

在荧光比色皿中，将 200 微升 30 纳摩尔 SBDS-FlAsH 放入各向异性缓冲液中，并滴定 2 微升 30 微摩尔 EFL1。充分混合，让反应静置3分钟，然后测量各向异性和荧光值。重复此过程，直到添加总体积 40 微升 EFL1。最后一步，将数据拟合到假定的绑定模型，如文本协议中所述。