基于 SELEX 的体外结合测定法，用于鉴定 RNA-蛋白质相互作用

通过指数富集 SELEX 对配体进行系统进化，可以鉴定蛋白质结合 RNA 序列。

首先，获得一个随机 RNA 库，其中包含放射性标记的 RNA，其随机序列折叠成高度特异性结构。与目标蛋白孵育。该蛋白质与具有特定序列和三维结构的 RNA 分子结合，而非特异性 RNA 保持未结合。

混合物通过硝化纤维素过滤器。未结合的 RNA 通过过滤器孔，而 RNA-蛋白质复合物保持保留。

含有 RNA-蛋白质复合物的过滤器切成片段。通过在降低靶蛋白浓度的情况下孵育 RNA 库来重复 RNA-蛋白质相互作用 - 仅允许高亲和力序列结合，而低亲和力序列无法结合。

该混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳。与低亲和力、未结合的 RNA 相比，RNA-蛋白质复合物在凝胶中缓慢迁移。X 射线凝胶成像显示与 RNA-蛋白质复合物位置相对应的带移。

含有复合物的凝胶部分切片。将蛋白酶 K 添加到过滤器片段和凝胶切片中，消化蛋白质并从复合物中释放 RNA。加入苯酚-氯仿并离心，将 RNA 与消化的蛋白质分离。

含RNA的上清液与乙酸钠和乙醇混合。离心机沉淀RNA。重悬于不含 RNase 的水中。逆转录RNA以互补DNA并PCR扩增DNA。

重复多轮基于过滤器和基于凝胶的分离，以获得靶蛋白特异性 DNA 序列池。

为了结合100微升反应体积的蛋白质和RNA，首先制备pH 7.5的10毫摩尔盐酸三酯，含有50毫摩尔氯化钾，1毫摩尔DTT，0.09微克每微升牛血清白蛋白，0.5单位每微升RNAsin，0.15微克每微升tRNA和1毫摩尔EDTA。然后，从适当的池中加入 30 微升重组蛋白 PTB 和 10 微升 RNA。

含有结合反应的试管放入温度块中，在25摄氏度下约30分钟。接下来，通过四轮选择和扩增将结合的 RNA 从未结合的 RNA 中分离出来。首先，通过连接到真空歧管的硝酸纤维素过滤器在室温下过滤 100 微升样品。RNA-蛋白质复合物保留在过滤器上。

使用无菌剃须刀片将过滤器切成碎片，然后将它们插入离心管中。将滤片浸入蛋白酶 K 缓冲液中，并将其放在玻璃杯上至少三个小时或过夜以回收 RNA。

要使RNA样品脱蛋白，请加入等体积的苯酚-氯仿，涡旋。然后在室温下高速离心五分钟。得到水相，再次用氯仿萃取。之后，将上清液与 pH 5.2 的 1/10 体积 3 摩尔乙酸钠和 2 至 3 体积的无水乙醇混合。

试管在-80摄氏度的冰箱中放置30分钟，然后高速离心10分钟。用70%乙醇重复洗涤和干燥步骤，并将RNA溶解在DEPC处理过的水中。在第一轮滤结合测定后，再进行三轮。

接下来，进行两轮转录、结合和扩增，以将蛋白质结合的 RNA 组分与未结合的组分分离。在 0.5x TBE 缓冲液中预制具有 60 比 1 丙烯酰胺比例的天然 5% 聚丙烯酰胺凝胶。然后，建立 RNA-蛋白质结合反应。

将凝胶放入充满 0.5x TBE 缓冲液的电泳装置中，在 4 摄氏度的冷藏室中。施加 250 伏 15 分钟，然后将结合反应移液到不同的孔中。然后，进一步，通过在250伏下运行电泳一到两个小时，从未结合的RNA中分离结合的RNA。

接下来，将凝胶暴露在 X 射线胶片上，并使用放射自显影识别结合 RNA 的位置。用结合的RNA切下凝胶切片并将其插入管中。压碎凝胶切片并在蛋白酶 K 缓冲液中孵育三小时或过夜。如前所述，用苯酚氯仿和氯仿重复提取。从溶解的RNA合成cDNA。

制备 20 微升反应，包括 2 微升 10x RT 缓冲液、2 微升 AMV 逆转录酶、1 微升逆引物、5 微升水和 10 微升溶解的 RNA。在42摄氏度下孵育60分钟。

前所述，使用 20 至 25 个 PCR 循环扩增 cDNA。重复RNA合成、蛋白质结合以及分离蛋白质结合和未结合部分的过程。