基于SELEX的体外结合实验鉴定RNA-蛋白质相互作用

通过指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，可以鉴定出与蛋白质结合的RNA序列。

首先，获得一个包含放射性标记RNA的随机化RNA文库，这些RNA具有随机序列并可折叠成高度特异性的结构。将该文库与目标蛋白共同孵育。蛋白质会结合具有特定序列和三维结构的RNA分子，而非特异性结合的RNA则保持游离状态。

将混合物通过硝酸纤维素滤膜。未结合的RNA会穿过滤膜孔隙，而RNA-蛋白质复合物则被截留。

将含有RNA-蛋白质复合物的滤膜切成碎片。通过将RNA文库与降低浓度的目标蛋白质孵育，重复RNA-蛋白质相互作用——仅允许高亲和力序列结合，而低亲和力序列无法结合。

将该混合物上样至聚丙烯酰胺凝胶并进行电泳。与低亲和力的未结合RNA相比，RNA-蛋白质复合物在凝胶中的迁移速度较慢。X射线凝胶成像显示对应于RNA-蛋白质复合物位置的条带迁移现象。

切下含有复合物的凝胶部分。将蛋白酶K加入滤膜碎片和凝胶切块中，消化蛋白质并释放复合物中的RNA。加入苯酚-氯仿后离心，使RNA与消化后的蛋白质分离。

将含有 RNA 的上清液与乙酸钠和乙醇混合。离心以沉淀 RNA。用无 RNase 的水重悬。将 RNA 反转录为互补 DNA，并对 DNA 进行 PCR 扩增。

通过多轮基于滤膜和基于凝胶的分离，获得目标蛋白特异性的DNA序列集合。

在100微升反应体系中结合蛋白质与RNA时，首先配制含有50毫摩尔氯化钾、1毫摩尔DTT、0.09微克/微升牛血清白蛋白、0.5单位/微升RNAsin、0.15微克/微升tRNA和1毫摩尔EDTA的10毫摩尔Tris-盐酸缓冲液（pH 7.5）。然后加入30微升重组蛋白PTB和10微升来自相应文库的RNA。

将含有结合反应的离心管置于25摄氏度的温控金属块中，孵育约30分钟。接着，通过四轮筛选与扩增，将结合的RNA与未结合的RNA进行分离。首先，在室温下将100微升样品通过连接真空泵的硝酸纤维素滤膜进行过滤。RNA-蛋白质复合物将保留在滤膜上。

使用无菌剃须刀片将滤膜切成碎片，并将其放入离心管中。将滤膜碎片浸入蛋白酶K缓冲液中，置于摇床中至少三小时或过夜，以回收RNA。

为了去除RNA样品中的蛋白质，加入等体积的苯酚-氯仿，涡旋振荡。然后在室温下高速离心五分钟。收集水相，并用氯仿再次萃取。随后，向 supernatant 中加入1/10体积的3摩尔乙酸钠（pH 5.2）以及两到三倍体积的无水乙醇，混匀。

将离心管置于 -80 摄氏度冰箱中 30 分钟，然后高速离心 10 分钟。用 70% 乙醇重复洗涤和干燥步骤，并将 RNA 溶解于经 DEPC 处理的水中。完成第一轮滤膜结合实验后，再进行三轮实验。

接下来，进行两轮转录、结合和扩增，以将蛋白质结合的RNA组分与未结合的组分分离。使用60:1的丙烯酰胺与双丙烯酰胺比例，在0.5× TBE缓冲液中预制一块5%的天然聚丙烯酰胺凝胶。然后，建立RNA-蛋白质结合反应。

将凝胶置于充满0.5x TBE缓冲液的电泳装置中，在4摄氏度的冷室中进行电泳。施加250伏电压，持续15分钟，然后将结合反应液加入不同的加样孔中。随后，在250伏电压下继续电泳1至2小时，以分离结合的RNA与未结合的RNA。

接下来，将凝胶暴露于X射线胶片，通过放射自显影确定结合RNA的位置。切下含有结合RNA的凝胶片段，并将其放入离心管中。研碎凝胶片段，加入蛋白酶K缓冲液，37 °C孵育三小时或过夜。按照前述方法，用酚-氯仿和氯仿重复抽提。从溶解的RNA中合成cDNA。

配制20微升反应体系，包含2微升10x RT缓冲液、2微升AMV逆转录酶、1微升逆转录引物、5微升水和10微升溶解的RNA。在42°C孵育60分钟。

使用20至25个PCR循环扩增cDNA，方法如前所述。重复进行RNA合成、蛋白质结合以及结合与未结合组分的分离过程。