利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

肌动蛋白单体以头尾相连的方式聚合形成细丝，称为微丝。同样，微管蛋白二聚体聚合成长的中空圆柱状微管。这些细胞骨架成分可维持细胞形态并促进细胞运动。

为了通过全内反射显微镜（TIRF）观察肌动蛋白-微管耦合动力学，请使用定制的成像装置。

成像组件由两张盖玻片组成：顶部为m-PEG硅烷涂层盖玻片，底部为生物素-PEG硅烷涂层盖玻片。两张盖玻片通过双面胶带在纵向隔开，并在两端密封，形成一个流动通道。

用移液器将BSA加入流动通道以预润湿腔室。加入链霉亲和素溶液并孵育。链霉亲和素分子会与连接在底部盖玻片PEG-硅烷上的生物素分子结合。

将流动TIRF缓冲液注入通道。加入细胞骨架混合溶液，其中包含未标记和绿色荧光标记的微管蛋白二聚体，以及未标记、生物素标记和紫色荧光标记的肌动蛋白单体。

接着，加入含有ATP——促进肌动蛋白聚合的试剂，GTP——促进微管蛋白聚合的试剂，以及肌动蛋白-微管耦联蛋白的反应溶液。孵育。

微管蛋白二聚体与GTP分子结合并聚合，而肌动蛋白单体则与ATP分子结合并聚合，分别形成微管和微丝。

将成像组件置于TIRF显微镜下，使用适当波长的激光激发荧光染料。

激发光在内部发生反射，并在玻璃-水界面附近产生一个光场，该区域因存在两种折射率不同的介质而选择性地激发荧光分子。在此区域内，微丝呈现紫色，微管呈现绿色。

将双面胶带裁剪成12条，每条长度为24毫米。移除胶带一侧的背衬，将胶带条粘贴至洁净成像室的六条凹槽旁边。再移除胶带另一侧的背衬，使各凹槽处的胶带粘性面暴露出来，然后将成像室胶带面朝上放置于洁净的表面上。

取一个小型称量皿，将环氧树脂与固化剂溶液按1:1比例混合，使用P1000移液器吸头吸取混合后的环氧树脂，在每个成像室凹槽末端的胶带条之间滴加一滴。随后，将胶带室或涂有环氧树脂的一面朝上，放置于洁净的表面上。

从70摄氏度的培养箱中取出带有涂层的盖玻片，用双蒸水对盖玻片的涂层面和未涂层面各冲洗六次。用过滤的氮气吹干，然后将盖玻片固定到成像室中，使涂层面朝向胶带一侧。

使用 P200 或 P1000 移液器吸头对胶带-玻璃界面施加压力，以确保胶带与盖玻片之间形成良好的密封。将组装好的腔室在室温下孵育至少 5 到 10 分钟，以使环氧树脂在使用前充分密封腔室壁。

灌流室在组装后 12 至 18 小时内失效。使用灌流泵，并通过灌流 50 微升 1% BSA 溶液以预处理成像室，随后依次更换灌流室中的预孵育溶液。

从鲁尔锁紧接头储液池中移除多余的缓冲液。然后，加入50微升浓度为0.005毫克/毫升的链霉亲和素，室温下孵育1至2分钟。从储液池中移除多余的缓冲液。

注入 50 微升 1% BSA 以封闭非特异性结合位点，孵育 10 至 30 秒。移除储液池中多余的缓冲液。接着，依次注入 50 微升预热的 1× TIRF 缓冲液、50 微升稳定化的、50% 生物素