利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

肌动蛋白单体以头尾相连的方式聚合形成细丝，称为微丝。同样，微管蛋白二聚体聚合成长的中空圆柱状微管。这些细胞骨架成分可维持细胞形态并促进细胞运动。

为了通过全内反射显微镜（TIRF）观察肌动蛋白-微管耦合动力学，请使用定制的成像装置。

成像组件由两张盖玻片组成：顶部为m-PEG硅烷涂层盖玻片，底部为生物素-PEG硅烷涂层盖玻片。两张盖玻片通过双面胶带在纵向隔开，并在两端密封，形成一个流动通道。

用移液器将BSA加入流动通道以预润湿腔室。加入链霉亲和素溶液并孵育。链霉亲和素分子会与连接在底部盖玻片PEG-硅烷上的生物素分子结合。

将流动TIRF缓冲液注入通道。加入细胞骨架混合溶液，其中包含未标记和绿色荧光标记的微管蛋白二聚体，以及未标记、生物素标记和紫色荧光标记的肌动蛋白单体。

接着，加入含有ATP——促进肌动蛋白聚合的试剂，GTP——促进微管蛋白聚合的试剂，以及肌动蛋白-微管耦联蛋白的反应溶液。孵育。

微管蛋白二聚体与GTP分子结合并聚合，而肌动蛋白单体则与ATP分子结合并聚合，分别形成微管和微丝。

将成像组件置于TIRF显微镜下，使用适当波长的激光激发荧光染料。

激发光在内部发生反射，并在玻璃-水界面附近产生一个光场，该区域因存在两种折射率不同的介质而选择性地激发荧光分子。在此区域内，微丝呈现紫色，微管呈现绿色。

将双面胶带裁剪成12条，每条长度为24毫米。移除胶带一侧的背衬，将胶带条粘贴至洁净成像室的六条凹槽旁边。再移除胶带另一侧的背衬，使各凹槽处的胶带粘性面暴露出来，然后将成像室胶带面朝上放置于洁净的表面上。

取一个小型称量皿，将环氧树脂与固化剂溶液按1:1比例混合，使用P1000移液器吸头吸取混合后的环氧树脂，在每个成像室凹槽末端的胶带条之间滴加一滴。随后，将胶带室或涂有环氧树脂的一面朝上，放置于洁净的表面上。

从70摄氏度的培养箱中取出带有涂层的盖玻片，用双蒸水对盖玻片的涂层面和未涂层面各冲洗六次。用过滤的氮气吹干，然后将盖玻片固定到成像室中，使涂层面朝向胶带一侧。

使用 P200 或 P1000 移液器吸头对胶带-玻璃界面施加压力，以确保胶带与盖玻片之间形成良好的密封。将组装好的腔室在室温下孵育至少 5 到 10 分钟，以使环氧树脂在使用前充分密封腔室壁。

灌流室在组装后 12 至 18 小时内失效。使用灌流泵，并通过灌流 50 微升 1% BSA 溶液以预处理成像室，随后依次更换灌流室中的预孵育溶液。

从鲁尔锁紧接头储液池中移除多余的缓冲液。然后，加入50微升浓度为0.005毫克/毫升的链霉亲和素，室温下孵育1至2分钟。从储液池中移除多余的缓冲液。

注入 50 微升 1% BSA 以封闭非特异性结合位点，孵育 10 至 30 秒。移除储液池中多余的缓冲液。接着，依次注入 50 微升预热的 1× TIRF 缓冲液、50 微升稳定化的、50% 生物素标记的微管成核种子（用 1× TIRF 缓冲液稀释）。

在成像第一个生化反应之前，将载物台或物镜加热装置设定为维持 35 至 37 摄氏度的温度，持续 30 分钟。然后，将采集间隔设置为每 5 秒一次，持续 15 至 20 分钟。接下来，首先调节聚合反应以启动肌动蛋白丝的组装，然后将 488 和 647 激光的曝光时间设为 50 至 100 毫秒，功率设为 5% 至 10%。

在647纳米波长下采集图像，并进行适当调整。随后，在第二个预处理的灌注孔中调整聚合反应，以启动微管组装。在488纳米波长下进行观察，并进行适当调整。

使用前不超过15分钟，将3微升10微摩尔的488标记微管蛋白与7.2微升100微摩尔的荧光未标记微管蛋白等分试样混合。然后，将3微升稀释的生物素化肌动蛋白与适量的荧光未标记和荧光标记肌动蛋白混合，使最终混合物中总肌动蛋白浓度为12.5微摩尔，其中荧光标记比例为10%至30%。

在成像前不超过15分钟，将2微升12.5微摩尔的肌动蛋白混合储备液与微管蛋白储备混合液混合，配制细胞骨架混合液。使用前置于冰上保存。

通过混合所有其他实验组分和蛋白质来制备蛋白质反应混合液，包括 2× TIRF 缓冲液、抗漂白剂、核苷酸、缓冲液以及辅助蛋白质。将细胞骨架混合液单独加入蛋白质反应混合液中，在 37 摄氏度下孵育 30 至 60 秒。

为启动反应，将蛋白质反应混合液加入细胞骨架混合液中并混匀。取50微升反应混合液，其中含有1倍TIRF缓冲液，并补充15微摩尔游离微管蛋白、1毫摩尔GTP、0.5微摩尔肌动蛋白单体以及适量的缓冲液对照，将其注入灌流室中。

使用显微镜软件录制延时电影，每5秒采集一次，持续15至20分钟。对新的灌流小室进行预处理，并用目标调控蛋白及缓冲液对照替换缓冲液体积。进行图像采集，以评估调控蛋白在新生肌动蛋白微管功能中的作用。