晶格光片显微镜,用于可视化活细胞中的受体-配体相互作用

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晶格光片显微镜 LLSM 能够以高时空分辨率可视化活细胞中的细胞-表面受体-配体相互作用。

取一份盖玻片,其中包含发射红色荧光的转导表达配体的细胞。将盖玻片池面朝上连接到涂有油脂的样品架上。将支架固定在显微镜载物台的压电上,以便在成像过程中进行精确的样品定位和扫描。调整软件设置以专注于单个表达配体的细胞。

表达受体的细胞悬液移液到盖玻片上。受体用绿色荧光团标记的抗体标记。对相互作用的细胞对进行成像。

显微镜的激发激光发射圆形线偏振激光束,穿过柱面透镜形成光片。光片被投射到调制器上,该调制器去除多余的衍射并将其转换为超薄晶格图案。

晶格光片照亮相互作用细胞对的超薄部分,相互作用细胞发出的荧光被垂直于入射光束捕获。在多个 Z 平面上对相互作用的细胞对进行成像,并使用高速相机在每个焦平面上捕获二维图像。

使用合适的软件,将这些图像组合成 z 堆栈——一个高分辨率的四维图像,展示了细胞-表面受体-配体相互作用的时空动力学。

LLSM浴液中加入10毫升水和30微升荧光素。首先,按图像(主页)将物体移动到图像位置,并查看单个容器激光束图案。

使用引导和预设感兴趣区域对齐激光束,使光束成为在各个方向上平衡的薄图案。光束也应该在取景器相机中显示为聚焦。使用两个镜面倾斜调节器、顶部对焦千分尺和物镜颜色来调整光束。

接下来,用至少 200 毫升的水清洗浴液和物镜,以完全去除任何荧光素。

要对标准荧光珠进行成像,请通过在"X 振镜范围"框中设置为 3 来打开抖动,然后按实时查看当前场。手动调整倾斜镜、物镜颜色和聚焦千分尺以获得最高灰度值。然后,根据需要进行调整,以获得物镜扫描、Z振镜、Z加物镜和样品扫描捕获模式的正确模式。之后,按 在样本扫描模式下执行 收集样本点扩散函数以进行去偏度和去卷积。将激光更改为三色模式,然后再次按执行

首先,将 100,000 个抗原呈递细胞添加到准备好的直径为 5 毫米的圆形盖玻片中,并让它们沉降 10 分钟。在样品架上涂上油脂,并将盖玻片添加到其中,从细胞面朝上。

接下来,在盖玻片背面加入一滴成像介质。将样品架拧到压电上,然后按图像(主页)。找到抗原呈递细胞进行成像,并确保LLSM和成像软件正常运行。

实时查看当前图像。沿 Z 方向移动以找到盖玻片和单元格。通过沿 Z 方向移动找到抗原呈递细胞的中心,然后按停止暂停激光。检查 3D 并输入所需的设置。按 Enter 键,然后按 Execute 收集数据。

将载物台降低到加载位置,并在成像培养基中直接滴加 50 微升 T 细胞,直接在盖玻片上。最好让移液器吸头末端形成一滴,然后将吸头接触浴液。单击图像(返回)将载物台抬回原处。

开始成像。请务必设置所需的 Z 堆栈和延时长度。例如,以 0.4 微米步长成像 60 个 Z 堆栈,并输入第 500 个时间帧。在达到 500 帧之前停止录制以避免光漂白。使用实时模式搜索细胞对,当准备就绪并输入所需的设置后,按执行以收集数据。

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Last updated: 4 July 2026