使用晶格光片显微镜可视化活细胞中受体-配体相互作用

晶格光片显微镜（LLSM）能够以高时空分辨率对活细胞中细胞表面受体-配体相互作用进行可视化观察。

取一个含有表达配体并发出红色荧光的转导细胞的盖玻片。将盖玻片细胞面向上固定在涂有润滑脂的样品托上。将托架固定在显微镜载物台的压电装置上，以便在成像过程中精确控制样品的位置和扫描。调整软件设置，使焦点对准单个表达配体的细胞。

将表达受体的细胞悬液用移液器滴加到盖玻片上。受体用绿色荧光标记的抗体进行标记。对相互作用的细胞对进行成像。

显微镜的激发激光器发射出圆形的线偏振激光束，该激光束穿过柱面透镜以形成光片。光片被投射到调制器上，调制器去除多余的衍射光，并将其转化为超薄的晶格图案。

晶格光片照射相互作用的细胞对的超薄切片区域，相互作用细胞发出的荧光被垂直于入射光束的探测器捕获。在多个Z平面成像相互作用的细胞对，并使用高速相机在每个焦平面上捕获二维图像。

使用合适的软件将这些图像合并，形成一个 z 轴堆叠图像——即一个高分辨率的四维图像，用于展示细胞表面受体-配体相互作用的空间和时间动态。

向LLSM浴液中加入10毫升水和30微升荧光素。首先，按图像（主页）将样品移至成像位置，并观察单个血管的激光束模式。

使用引导装置和预设的兴趣区域，调整激光束，使其形成一个在各个方向上均均衡的细光束图案。在寻像相机中，光束应呈现为聚焦状态。通过两个镜片倾斜调节器、顶部聚焦微米计和物镜颜色来调节光束。

接下来，用至少 200 毫升水清洗浴槽和物镜，以彻底去除所有荧光素。

为了对标准荧光微球进行成像，打开 抖动 将数值设为3 X Galvo 范围 盒，并按压 实时 以查看当前视野。手动调节倾斜镜、物镜颜色和聚焦微米计，以获得最高的灰度值。然后根据需要进行调整，以获取物镜扫描、Z 轴振镜、Z 轴加物镜以及样品扫描捕获模式下的合适图像模式。完成后，按下 执行 在 样本 扫描 用于采集样本点扩散函数以进行去倾斜和去卷积。将激光器切换至三色模式，然后按下 执行 再次。

首先，将100,000个抗原呈递细胞加入已准备好的直径为5毫米的圆形盖玻片上，静置10分钟使其沉降。在样品托上涂抹润滑脂，将盖玻片细胞面朝上放入样品托中。

接下来，在盖玻片背面加入一滴成像介质。将样品架拧到压电装置上，然后按下成像（主页）。找到一个需要成像的抗原呈递细胞，并确保LLSM和成像软件正常工作。

点击Live以查看当前图像。沿Z轴移动以找到盖玻片和细胞。通过Z方向移动找到抗原呈递细胞的中心，然后点击Stop暂停激光。勾选3D并输入所需设置。按Enter，然后点击Execute以采集数据。

将载物台降至加载位置，然后以成像培养基将50微升T细胞逐滴加入，直接滴加在盖玻片上方。最好让液滴在移液器吸头末端形成后，再将吸头轻轻接触浴液。通过点击成像（返回）将载物台升回原位。

开始成像。务必设置所需的Z轴层厚和时间序列长度。例如，以0.4微米的步长采集60层Z轴图像，并设置500个时间点。在达到500帧之前停止记录，以避免光漂白。使用实时模式寻找细胞对，当准备就绪并输入所需设置后，点击执行以开始采集数据。