暗场显微镜可视化纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

0 views • 5:15 min • July 8th, 2025

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为了使用暗场显微镜研究活细胞膜上的金纳米棒扩散动力学,DFM与单颗粒跟踪相结合,从在含有合适培养基的培养皿中进行灭菌盖玻片开始。将细胞悬液添加到盖玻片上。该培养基促进细胞生长。

与带正电的金纳米棒一起孵育,这些纳米棒通过静电相互作用附到带负电的细胞膜上。将培养基从培养皿移液到载玻片的凹槽中。将盖玻片池面朝下放在凹槽上,并密封。

将载玻片放在暗场显微镜载物台上。显微镜用穿过专用暗场聚光器的高角度斜光照亮样品。

米棒被照亮后,纳米棒表面的自由电子以与入射光共振的频率振荡。振荡电子以物镜捕获的特定波长散射光,从而实现纳米棒可视化。

同样,由脂质和蛋白质组成的细胞膜以比周围介质更高的折射率散射入射光,从而在黑暗背景下产生明亮的图像。捕获时间序列 DFM 图像。

使用合适的软件,对DFM图像进行单颗粒跟踪分析,以高时空分辨率可视化纳米棒通过细胞膜的扩散。

首先在火焰上燃烧浸有乙醇的玻璃盖玻片,然后将盖玻片放入含有 2 毫升不含酚红的细胞培养基的 35 x 10 毫米细胞培养皿中。将 50 微升感兴趣的细胞悬浮液加入盖玻片上,轻轻地来回和左右摇动培养皿,使细胞均匀分布。

培养皿放入细胞培养箱中约 12 小时,直到细胞达到 20% 至 40% 的汇合度,然后向培养皿中加入 20 微升 CTAB 包被的金纳米棒。轻轻摇晃以使纳米棒均匀地分散在培养皿上后,将培养皿置于加湿的环境中 5 分钟。

孵育结束时,将 100 微升上清液从培养皿中缓慢转移到载玻片的凹槽中,并小心地将盖玻片细胞面朝下放在载玻片凹槽上。然后,用指甲油密封盖玻片的边缘,让指甲油干燥,然后将载玻片放在暗场显微镜载物台上。

对于通过暗场显微镜进行单颗粒跟踪,将一滴油滴在油浸暗场冷凝器上,然后转动旋钮,直到冷凝器接触载玻片。将一滴油滴在盖板玻璃的顶部,然后转动对焦旋钮,直到 60 倍油浸物镜接触到油。

打开光源,轻轻转动对焦旋钮,对焦成像平面。然后,单击显微镜软件中的相机图标,使用彩色CMOS相机记录样品散射光图像时间序列,并将图像保存为TIFF格式。

要提取单个长期轨迹,请在 ImageJ 中打开图像,然后单击图像 | 键入 |8 位,将图像从 RGB 模式转换为 8 位模式。要调整对比度,请单击"图像"|"调整"|"亮度"|"对比度",然后设置参数。选择一个目标粒子,然后使用"Control + X"截断时间序列背景。

单击"插件"|"Particle Tracker Classic"|"粒子跟踪器"以打开"粒子检测和粒子链接"窗口,并将半径设置为 6,将截止值设置为 0,将百分位数设置为 0.01%。将链接范围设置为 10,位移设置为 10,然后单击"确定"打开粒子跟踪器结果窗口以查看结果。

单击"可视化所有轨迹"以检查生成的轨迹。如果软件生成的轨迹与金纳米棒的移动轨迹匹配,请单击"保存完整报告"以保存结果。如果软件生成的轨迹与金纳米棒的运动轨迹不匹配,点击"重新链接粒子",将检测到的颗粒与不同的链接范围和百分位参数重新链接。

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Last updated: 18 July 2026