暗视野显微镜观察纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

为了利用暗场显微镜（DFM）结合单颗粒追踪技术研究金纳米棒在活细胞膜上的扩散动力学，首先将经过灭菌的盖玻片置于含有适当培养基的培养皿中。将细胞悬液滴加到盖玻片上。培养基有助于细胞生长。

孵育带正电荷的金纳米棒，使其吸附到带负电荷的细胞膜上 通过 静电相互作用。用移液器将培养皿中的培养基转移至玻璃载片的凹槽中。将盖玻片细胞面朝下放置于凹槽上，并进行封固。

将载玻片置于暗视野显微镜载物台上。显微镜通过特制的暗视野聚光器，以高角度斜射光照射样本。

当纳米棒受到光照时，其表面的自由电子以与入射光共振的频率发生振荡。这些振荡的电子在特定波长处散射光线，并被物镜捕获，从而实现对纳米棒的可视化观察。

类似地，细胞膜由脂质和蛋白质组成，其折射率高于周围介质，会散射入射光，从而在暗背景上形成明亮的图像。采集时间序列的暗视野显微图像。

使用合适的软件对暗场显微图像进行单颗粒追踪分析，以高时空分辨率可视化纳米棒穿过细胞膜的扩散过程。

首先将浸有乙醇的玻璃盖玻片在火焰上灼烧，然后将其放入含有 2 毫升不含酚红的细胞培养基的 35 mm × 10 mm 细胞培养皿中。将 50 微升目标细胞悬液滴加到盖玻片上，轻轻前后左右摇动培养皿，使细胞均匀分布。

将培养皿放入细胞培养箱中，孵育约12小时，直至细胞融合度达到20%至40%，然后向培养皿中加入20 µL CTAB包被的金纳米棒。轻轻振荡培养皿，使纳米棒均匀分散，随后将培养皿置于湿润环境中孵育5分钟。

孵育结束后，缓慢将培养皿中100微升上清液转移至载玻片的凹槽内，小心地将盖玻片细胞面朝下放置在载玻片的凹槽上。然后，用指甲油密封盖玻片边缘，并在将载玻片置于暗视野显微镜载物台前，待指甲油完全干燥。

进行暗场显微镜单颗粒追踪时，将一滴浸油滴加到油浸暗场聚光镜上，并转动旋钮，直至聚光镜与玻片接触。再将一滴浸油滴加到盖玻片顶部，转动调焦旋钮，直至60倍油镜物镜接触到油滴。

打开光源，轻微转动调焦旋钮以聚焦成像平面。然后，在显微镜软件中点击相机图标，使用彩色CMOS相机记录样品散射光图像的时间序列，并将图像保存为TIFF格式。

为了提取单条长期轨迹，使用 ImageJ 打开图像，然后点击 图像 | 类型 | 和 8 位，将图像从 RGB 模式转换为 8 位模式。为调整对比度，点击 图像 | 调整 | 亮度 | 对比度，并设置相应参数。选择目标粒子，使用“Control + X”剪切时间序列背景。

单击 插件 | 粒子追踪经典版 | 和 粒子追踪，打开粒子检测与粒子连接窗口，将半径设置为 6，截断值设置为 0，百分位设置为 0.01%。将连接范围设置为 10，位移设置为 10，然后单击 “确定”，打开粒子追踪结果窗口查看结果。

单击“可视化所有轨迹”以检查生成的轨迹。如果软件生成的轨迹与金纳米棒的运动轨迹一致，请单击“保存完整报告”以保存结果。如果软件生成的轨迹与金纳米棒的运动轨迹不匹配，请单击“重新连接粒子”，并使用不同的连接范围和百分位参数重新连接检测到的粒子。