高速时间序列原子力显微镜捕捉核小体动态

核小体——真核生物DNA的重复单位——由DNA片段缠绕在组蛋白核心上构成。组蛋白核心周围DNA的解缠绕对于核小体动力学至关重要。

为了捕获核小体动态，首先将一块光滑且经过功能化的云母基底安装到原子力显微镜（AFM）的扫描台。在基底上覆盖含有核小体的缓冲液。

带负电荷的核小体DNA与功能化云母表面的正电荷相互作用，从而将其固定在表面。用缓冲液洗涤固定的云母基底，以防止核小体过度聚集。

将含有核小体的扫描台转移至成像室中，成像室内已安装悬臂梁，其探针位于边缘并朝上指向核小体。

用成像缓冲液填充样品室。将激光束对准悬臂背面，以确保准确测量偏转。

AFM针尖在接近完全缠绕的核小体处振荡，并在表面扫描，以定期测量核小体的高度。

DNA 自发解缠会增加核小体的高度，改变探针的振荡，从而引起悬臂偏转。该悬臂偏转会改变反射激光束的位置，位置敏感探测器检测到这一变化后，生成核小体的形貌图像。

在原子力显微镜图像中，组蛋白核心呈现为一个发光的斑点，随着时间推移，其上缠绕的DNA逐渐解旋并高度增加，表明核小体具有动态特性。

使用玻璃棒-扫描仪胶水将玻璃棒固定在原子力显微镜（AFM）扫描仪平台上，静置干燥至少10分钟。在此期间，从较大的云母片上打孔制备直径为1.5毫米、厚度为0.1毫米的圆形云母片。使用高速原子力显微镜专用的云母-玻璃棒胶水将云母片粘附至高速原子力显微镜的玻璃棒上，粘附后静置至少10分钟，期间避免触碰，使其充分干燥。

然后，使用压敏胶带从云母上剥离层数，直至在胶带上观察到一个剥离良好的层。接着，将1微升50毫摩尔的APS储备液溶于99微升去离子蒸馏水中，配制成500微摩尔的APS溶液。取2.5微升该溶液滴加到新近剥离的云母表面，并让其表面修饰反应30分钟。

孵育结束后，用去离子蒸馏水进行多次冲洗，每次加入3微升。每次冲洗后，将无纺布擦拭纸置于云母片边缘，彻底去除水分。最后一次冲洗后，在表面加入3微升去离子蒸馏水，静置至少5分钟，以去除任何非特异性结合的APS。

接下来，将探针放入高速原子力显微镜（AFM）样品 holder 中，并将 holder 置于 AFM 样品台上，使针尖朝上。先用 100 µL 去离子蒸馏水冲洗 holder，随后用 0.22 µm 滤膜过滤的核小体成像缓冲液冲洗两次，每次 100 µL。完成冲洗后，向腔室中加入 100 µL 核小体成像缓冲液，使针尖完全浸没。

调整悬臂的位置，直至其被激光照射到。然后，用过滤的核小体成像缓冲液冲洗APS-云母片五次，每次使用4微升。将1微升核小体组装原液稀释至250微升过滤的核小体成像缓冲液中，得到终浓度为1纳摩尔的核小体溶液。

取2.5 µL该稀释液滴加于表面，静置2分钟。用4 µL核小体成像缓冲液冲洗表面两次，以避免过度密集。最后一次冲洗后，使表面保留成像缓冲液覆盖。将扫描仪和样品置于尖端支架上方，使样品朝下。

开始操作时，使用自动接近功能，将设定点振幅设为接近自由振荡振幅的值。调节设定点，直到能够良好追踪表面。然后，将成像区域设为约150乘以150纳米至200乘以200纳米，数据采集速率约为每成像帧300毫秒。