透射电子显微镜定量分析人体骨骼肌中糖原分布

糖原是一种支链葡萄糖聚合物，存在于人体骨骼肌的肌原纤维间、肌原纤维内和肌膜下等亚细胞区域，是肌肉中的能量储备物质。

为了利用透射电子显微镜（TEM）定量分析亚细胞水平的糖原分布，需获取分离的人体骨骼肌组织。使用戊二醛固定以保存组织结构。随后将组织在四氧化锇与亚铁氰化钾溶液中进行后固定。

还原态的锇-亚铁氰化物复合物可结合糖原中的羟基，从而增强肌肉中糖原颗粒的对比度。此外，膜结构和肌质网——一种膜包被的细胞器——也会被染色。

用浓度递增的乙醇对组织进行脱水。将组织包埋于树脂中，形成固体包埋块。切取纵行排列肌纤维的超薄切片，并转移至透射电镜载网上。

将载网浸入醋酸铀酰等重金属溶液中。铀酰离子可与带负电荷的脂质和蛋白质结合，使其具有较高的电子密度。随后用柠檬酸铅溶液染色。

铅离子会结合经锇染色的区域，包括糖原颗粒，从而增强对比度。它们还会结合与醋酸铀酰反应的区域，增加电子不透明性。

在透射电子显微镜成像过程中，当电子束穿过组织时，被染色的电子致密区域（包括糖原）会散射更多的电子，而未染色区域则允许电子通过。

在生成的高对比度透射电镜图像中，糖原颗粒清晰且呈深色；未染色区域较亮，有助于观察和量化肌肉中亚细胞糖原的分布情况。

从肌肉活检组织或整块肌肉中分离出一个小型标本，其在任何方向上的最大直径为1毫米，且纵向长度大于横截面尺寸。

将样品放入含有冷初级固定液的离心管中，在5摄氏度下保存24小时。随后，用0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液洗涤样品4次。使用移液管从管中移除用过的缓冲液，注意不要触碰样品，然后加入新鲜缓冲液。在4摄氏度下，用含1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾的0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液对样品进行后固定，处理120分钟。

在室温下用双蒸水冲洗样本两次。在室温下将样本浸入梯度浓度的乙醇中进行脱水。在室温下，使用所述体积比的环氧丙烷与环氧树脂梯度混合液对样本进行浸透处理。

第二天，将样品包埋于模具中的100%新鲜环氧树脂内，并在60°C下聚合48小时。

将样品块固定在超薄切片机的样品夹上。用剃刀片修整样品块表面，直至暴露组织层面。在样品前方安装金刚石刀，并调整样品表面与刀刃平行。

使用金刚石刀切出厚度为1微米的半薄切片，以检查样品的取向。用甲苯胺蓝对半薄切片进行染色，以便在光学显微镜下观察。随后进一步修整包埋块，缩小感兴趣区域，以获得合适的超薄切片。

使用第二把金刚石刀切割60至70纳米厚度的超薄切片。用Perfect Loop将1至2片切片收集到单孔铜网上。对切片进行染色时，先将铜网浸入醋酸铀酰溶液中20分钟，用双蒸水洗涤，然后将铜网浸入柠檬酸铅溶液中15分钟，再用双蒸水重新洗涤。

打开透射电子显微镜、计算机及图像记录软件。使用数字慢扫描CCD相机及其配套成像软件记录数字图像。将载有多切片的载网插入显微镜样品台后，先在低倍镜下观察载网，选择质量最佳的切片，并确定肌纤维的走向。

接下来，在30,000倍以上的放大倍数下对图像进行聚焦，使电子束中心对准切片中的一个周边纤维，并在所需放大倍数下以1秒曝光时间采集图像。确保图像在纤维的长度和宽度方向上以随机但系统化的方式分布，以获得无偏结果，并重复成像过程，直至完成6至10根纤维的成像。

通过点击文件，然后选择打开，将图像导入ImageJ。通过点击分析，然后选择设置比例尺，设置全局比例尺以匹配图像的原始尺寸。要放大至100%，请单击图像，进入缩放，然后点击放大。

使用工具菜单中的直线工具，测量每张肌原纤维区域图像中一个Z线的厚度，并计算6至10根纤维中每根纤维的平均Z线厚度。使用分段线工具测量位于肌膜下区域下方可见的最外侧肌原纤维的长度。

要插入网格，请点击 分析，选择 工具，然后选择 网格。将每点面积设置为 32,400 平方纳米。在 12 张肌膜下图像中，统计交叉点与肌膜下糖原相交的次数。

单击分析，然后选择工具，接着选择网格，并将每点面积设置为160,000平方纳米。统计12张肌原纤维图像中穿过肌内肌原纤维间隙的交点数量。

然后，再次点击 分析，选择 工具，然后选择 网格。现在，将 每点面积 设置为 3,600 平方纳米。统计在 12 张肌原纤维图像中，十字交叉点与肌原纤维内糖原相交的次数。

通过点击分析，然后选择工具，再选择网格，插入一个网格，并将每点面积设置为32,400平方纳米。统计在12张肌原纤维图像中，十字交叉点与肌原纤维间糖原相交的次数。

使用32,400平方纳米的网格随机选择糖原颗粒，从左上角的方格开始，必要时向左移动。使用直线工具，对每张12幅图像中每个池内随机选择的5个糖原颗粒测量其直径，以获得每个池每根纤维平均60个颗粒的数据。