透射电子显微镜量化人骨骼肌中糖原分布

糖原是一种支链葡萄糖聚合物，是人体骨骼肌内亚细胞肌原纤维间、肌原纤维内和肌膜下隔室中的能量储备。

使用透射电子显微镜（TEM）量化亚细胞糖原分布，获得分离的人类骨骼肌组织。用戊二醛固定以保留组织结构。将组织固定在四氧化锇和亚铁氰化钾溶液中。

还原的亚铁氰化锇复合物与糖原中的羟基结合，改善了糖原颗粒在肌肉中的对比度。此外，膜和肌浆网（一种膜结合的细胞器）也会被染色。

增加乙醇浓度的情况下使组织脱水。嵌入树脂中，形成实心块。获得具有纵向肌纤维的超薄切片;转移到 TEM 网格上。

将网格浸入乙酸铀酰、重金属溶液中。铀酰离子与带负电荷的脂质和蛋白质结合，使它们具有电子密度。用柠檬酸铅溶液染色。

铅离子与锇染色区域（包括糖原颗粒）结合，增强对比度。它们还与乙酸铀酰反应区域结合，增强电子不透明度。

在 TEM 成像过程中，当电子束穿过组织时，染色的电子密集区域（包括糖原）会散射更多的电子，而未染色的区域则传输电子。

在产生的高对比度 TEM 图像中，糖原颗粒显得清晰而黑暗;未染色区域看起来更亮，有助于肌肉中亚细胞糖原分布的可视化和量化。

从肌肉活检或整个肌肉中分离出一个小标本，该标本在任何方向上的最大直径为 1 毫米，纵向比横截面长。

标本放入装有冷初级固定溶液的管中。在5摄氏度下储存24小时。然后，在0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液中洗涤标本4次。使用转移移液器，从管中取出用过的缓冲液，保持标本不变，然后加入新鲜缓冲液。用 1% 四氧化锇和 1.5% 亚铁氰化钾在 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲液中在 4 摄氏度下固定 120 分钟。

室温下用双蒸水冲洗样品两次。在室温下浸入一系列分级乙醇中脱水。使用上述体积比在室温下用环氧丙烷和 epossidic 树脂分级混合物浸润样品。

第二天，将样品嵌入模具中的 100% 新鲜 epossidic 树脂中，并在 60 摄氏度下聚合 48 小时。

标本块安装在超切片机支架上。用剃须刀片修剪表面的块，以达到组织水平。在样品前面安装一把金刚石刀，并将样品表面平行

用金刚石刀制作 1 微米厚的半薄切片，以检查样品的方向。用甲苯胺蓝染色半薄切片，以便用光学显微镜观察。然后，进一步修剪块以减少感兴趣的区域，以获得适当的超薄切片。

用第二把金刚石刀切割 60 至 70 纳米厚度的超薄切片。使用完美环在单孔铜网格上收集 1 到 2 个部分。为了对比切片，将网格浸入醋酸铀酰溶液中20分钟，并在双蒸水中洗涤网格，然后，将网格浸入柠檬酸铅中15分钟，然后在双蒸水中重新清洗网格。

透射电子显微镜、计算机和图像记录软件。使用数字慢扫描CCD相机和相关成像软件记录数字图像。在显微镜阶段插入具有多个切片的网格后，首先以低倍率筛选网格以选择质量最好的切片，并确定肌纤维的方向。

接下来，将图像聚焦在30,000以上的放大倍率上，光束以切片中的外围光纤为中心，并以所需的放大倍率记录曝光时间为1秒的图像。确保图像以随机但系统的顺序分布在光纤的长度和宽度上，以获得无偏见的结果，并重复成像直到成像 6 到 10 根光纤。

单击"文件"，然后单击"打开"将图像导入 imageJ。通过单击"分析"，然后单击"设置比例"来设置全局比例以匹配图像的原始大小。要放大 100%，请单击"图像"，转到"缩放"，然后单击"进"。

使用"工具"菜单中的"直线"工具测量肌原纤维空间每张图像一个 Z 盘的厚度，并计算 6 至 10 根纤维中每根纤维的平均 Z 盘厚度。使用分段线工具测量最外层肌原纤维的长度，在肌膜下区域下方可见。

要插入网格，请单击"分析"，选择"工具"，然后选择"网格"。现在将"每点面积"设置为 32,400 平方纳米。在 12 张肌膜下图像中，计算交叉撞击肌膜下糖原的可用长度内的命中次数。

通过单击"分析"插入网格，然后选择"工具"，然后选择"网格"，并将"每点面积"设置为 160,000 平方纳米。计算 12 张肌原纤维图像中的命中次数，其中十字击中肌原纤维内空间。

然后，要插入网格，请单击"分析"，选择"工具"，然后选择"网格"。现在，将"每点面积"设置为 3,600 平方纳米。计算 12 张肌原纤维图像中十字撞击肌原纤维内糖原的命中次数。

通过单击"分析"插入网格，然后选择"工具"，然后选择"网格"，并将"每点面积"设置为 32,400 平方纳米。计算 12 张肌原纤维图像中交叉撞击肌原纤维间糖原的命中次数。

使用32,400平方纳米的网格随机选择糖原颗粒，从左上角的正方形开始，必要时向左移动。使用直线工具，测量 12 张图像中每个池中每个池的 5 个随机选择的糖原颗粒的直径，以获得每根纤维中每个池的平均 60 个颗粒。