活体荧光显微镜观察微血管血栓形成

活体荧光显微镜可用于研究微血管损伤部位血栓（即血凝块）形成过程中光毒性的诱导作用。

首先取一只已注射光毒性荧光标记多糖的麻醉无毛小鼠。将小鼠俯卧于加热平台上，以维持生理温度，确保正常的血液循环。

将耳部顶端置于活体荧光显微镜下。在光照激发下，荧光染料会发射荧光，从而实现对微血管血流的监测。提高光照强度以诱导血栓形成。

荧光基团吸收高强度光后，与分子氧反应生成活性氧物种。这些分子可引起内皮细胞的氧化应激，从而导致细胞损伤及内皮下基质的暴露。

受损细胞释放血栓介质，这些介质连接内皮下基质中暴露的胶原与循环中的血小板，血小板随后结合至这些介质 通过 特异性受体。

这种结合会激活血小板，导致效应分子的释放，从而激活并募集其他循环中的血小板至损伤部位。循环中的纤维蛋白原蛋白与活化血小板上的纤维蛋白原受体结合，将血小板连接在一起形成血小板栓。

观察血流受限情况，以确认血小板栓塞——即血栓形成的第一步。

将动物置于体视显微镜下的平台上，使用10倍放大倍数。若需观察右耳，先准备左侧颈静脉：沿头尾方向在颈部皮肤做一5毫米切口，然后使用显微镊子和显微剪分离皮下组织，再将静脉从其外膜中游离出来，注意勿触碰血管本身。

现在，使用先前准备好的胰岛素注射器注射荧光染料。用显微镊子小心夹住血管壁，注意不要刺穿静脉。将注射器针头刺入扩张的血管壁，静脉内注射 FITC-葡聚糖。拔出针头，并用棉签止血。避免血液和染料污染耳部。

将动物转移到加热板上，置于一个带有加热板插槽和一个0.5厘米高用于固定耳朵平面的丙烯酸玻璃装置中。使用粘性绷带将动物以俯卧位固定在加热板上。将耳根部的凸面软骨置于耳朵平面旁边，使耳尖部分能够平整地放置在平面上。在丙烯酸玻璃板上滴加一滴室温的水。用棉签吸取水滴，并利用毛细作用力使耳部平面贴附于丙烯酸玻璃板上。

耳廓应尽可能平放，尽管软骨使耳廓呈凸面形状。因此，仅应将耳廓较柔软的远端部分放置在肢端玻璃板上。为避免组织损伤及冷冻染料外渗，应尽量减少使用镊子接触耳朵。

接下来，向耳部凸起的背侧滴加一滴水。小心地将一张盖玻片置于耳部，避免压迫进入耳部的基底血管。使用棉签尽可能清除盖玻片下方的水分，以最大限度减少盖玻片与耳部目标血管之间的距离。

首先调整活体荧光显微镜以观察FITC-葡聚糖。将准备好的动物转移至活体荧光显微镜的载物台上。使用5倍、10倍和20倍放大倍数以及20%的光照强度，寻找直径为50至60微米且具有顺行血流的静脉血管。

向盖玻片上添加一滴室温水，以用于63倍物镜的水浸。在滴加水滴后立即开始记录血管20秒，以评估管径和血流的基础值。在注射FITC-葡聚糖5分钟后开始血栓诱导。为此，将光照强度调至100%。

在光毒性血栓诱导过程中，每30秒内关闭显微镜光圈2秒，以检查血流是否发生阻塞。若血流仍然持续，需再次打开光圈。若血流静止达30秒或更长时间，或出现逆向血流，则判定该血管已发生阻塞。在注射FITC-葡聚糖后1小时内，每只耳朵选择并阻塞五根血管。