用于分析 DNA 双链断裂的免疫荧光显微镜

为了使用免疫荧光显微镜观察DNA双链断裂处的特定DNA损伤反应蛋白，DSB，位点，从含有具有DSB的人单核细胞单层的显微镜载玻片开始。用多聚甲醛固定细胞。

用非离子去污剂处理，透化膜以访问细胞内靶标。加入含蛋白质的封闭溶液，阻断细胞的非特异性结合位点。与与靶反应蛋白结合的一抗孵育。

用标有不同荧光团的二抗混合物进行处理，以特异性结合附着在蛋白质上的各自一抗。用DAPI染色DNA。添加封固剂;安装盖玻片。

在荧光显微镜检查中，入射光束到达激发滤光片，允许特定激发波长的光通过。到达二向色镜（分束器）后，激发光选择性地反射到物镜上，物镜将光聚焦到样品上。

入射激发光将荧光团的电子激发到更高的能量状态。返回基态后，电子发射出波长较长的光，被物镜收集，并传递回二向色镜。

反射镜允许发射的荧光光通过发射滤光片，这使得所需的荧光光只能到达检测器。处理图像。分析不同颜色的荧光病灶，以可视化 DNA 损伤反应蛋白在 DSB 位点的共定位。

心每个制剂的 1 x 10⁵ 个细胞，制备两个带有患者样本单核细胞的细胞离心。用 200 微升 4% PFA 固定细胞 10 分钟。

固定后，在摇床上用30毫升PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟。然后，用 200 微升 0.1% Octoxinol-9 透化细胞 10 分钟。在实验室摇床上用 30 毫升 5% 封闭溶液轻轻洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。在 30 毫升新鲜的 5% 封闭溶液中封闭细胞一小时。

用4%多聚甲醛和0.1%奥托辛醇-9固定和透化细胞，明显保留了γH2AX和53BP1病灶。

一种细胞制剂与小鼠单克隆抗γ H2AX抗体一起孵育，另一种细胞制剂与小鼠单克隆抗γH2AX抗体和多克隆兔抗53BP1抗体在4摄氏度下孵育过夜。

强烈建议使用经过验证的抗 γ H2AX 和抗 53BP1 抗体。

孵育后，在实验室摇床上用 30 毫升 2% 封闭溶液轻轻洗涤细胞 3 次，每 5 分钟一次。

接下来，将细胞的第一个制剂与在2%封闭溶液中稀释为1/500的Alexa488偶联山羊抗小鼠二抗孵育。将细胞的第二种制剂与Alexa488偶联的山羊抗小鼠二抗和Alexa555偶联的驴抗兔二抗在2%封闭溶液中稀释为500分之一。

实验室摇床上用 30 毫升 PBS 轻轻洗涤细胞 3 次。取出PBS并用封片剂封片细胞。小心地，在封片介质顶部放一个盖玻片，以免嵌入气泡。等待至少三个小时让封片剂硬化，然后再通过荧光显微镜分析细胞。

最后，在100倍物镜放大倍率成像期间，使用配备DAPI，Alexa488和Cy3滤光片的荧光显微镜分析细胞核中的γ H2AX和53BP1病灶。