利用核磁共振波谱法鉴定蛋白质中的多位点磷酸化

蛋白质中的多重磷酸化是指在蛋白质的不同位点（特别是丝氨酸和苏氨酸残基）上添加磷酸基团。

为了鉴定蛋白质中的多个磷酸化位点，首先从一个含有用氮-15标记的磷酸化蛋白质的离心管开始，这种标记有助于区分蛋白质中的酰胺氢与其他氢原子。

加入内标核磁共振（NMR）参考化合物，以准确测量相对共振频率。将混合物转移至核磁共振（NMR）管中。将NMR管插入旋转接口，并置于核磁共振波谱仪中。

磷酸基团的存在对磷酸化的丝氨酸和苏氨酸残基产生吸电子效应。因此，与其它酰胺氢相比，磷酸化残基的酰胺氢表现出去屏蔽效应，电子密度较低。

具有不同电子环境的酰胺氢原子在原子核周围经历不同的磁场，从而达到低能态。

施加一个短暂的射频脉冲，使氢原子核基于其电子环境在特定共振频率下被激发至较高能态。

在弛豫过程中，原子核通过释放吸收的能量回到低能态，所释放的能量被检测并产生核磁共振信号。

绘制代表各个酰胺氢的一维核磁共振谱图。

比较磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的谱图。磷酸化蛋白的核磁共振谱中出现额外的共振峰，表明存在多个磷酸化位点。

将4毫克冻干的¹⁵N和¹³C标记的ERK磷酸化Tau溶于400微升NMR缓冲液中。加入5%的重水用于NMR波谱仪的磁场锁场，并加入1毫摩尔的TMSP作为NMR信号的内标。同时，加入10微升40倍浓度的蛋白酶抑制剂混合物储备液。

使用带长针头的电子移液器或巴斯德移液管，将样品转移至5毫升核磁共振（NMR）样品管中。用推杆封闭NMR样品管。通过移动推杆，除去推杆与液体之间夹带的气泡。

将核磁共振（NMR）样品管放入转子中。使用合适的量规调节其在转子中的垂直位置，使样品溶液的大部分位于NMR线圈内部。接着，在磁体控制系统窗口中点击“Lift”，启动NMR仪器的气流。小心地将装有样品管的转子置于磁体孔道顶部的气流中，随后停止气流，使样品管下降并准确就位至磁体内部的探头中。

待样品平衡至 25 摄氏度后，在命令行中输入 'atmm'，以对探头进行半自动调谐和匹配，从而优化功率传输。然后，在磁体控制系统窗口中点击 “Lock”，以启动光谱仪的磁场频率锁定功能。

通过在命令行中输入 'topshim gui' 打开匀场窗口，以启动匀场程序，优化样品位置处磁场的均匀性。然后，在匀场窗口中点击 “开始”。检查残余 B 零标准偏差，以确认匀场效果是否达到最佳。

接下来，校准 P1 参数，即质子射频脉冲的持续时间，单位为微秒。该参数用于实现质子自旋磁化的 90 度翻转。通过水分子中质子的一维谱图，以 360 度脉冲为目标进行优化。

通过将 01 参数设置为一维谱中的质子水峰频率，来调整频率偏移。最后，在命令行中输入 'zg'，开始采集一维质子谱。