研究DNA-蛋白质相互作用的圆二色光谱技术

依赖ATP的染色质重塑蛋白通过以ATP依赖的方式改变DNA构象，从而在紧密包装的染色质中调控基因表达。

为了利用圆二色性（CD）光谱研究染色质重塑因子与DNA的相互作用，取双链DNA寡核苷酸溶液，加热使其变性，然后置于冰上。

快速冷却导致DNA在复性的同时形成二级结构。双链向单链转变的区域为染色质重塑因子提供了最佳结合位点。

将加热后冷却的DNA加入比色皿中。加入含有ATP依赖性染色质重塑复合物、ATP和镁离子的缓冲液。

重塑复合物结合到DNA上，随后镁离子结合的ATP与蛋白质结合——从而激活该复合物。被激活的重塑复合物水解ATP——诱导DNA形成茎环构象。

将具有90°相位差的左旋和右旋圆偏振光通过样品。光学活性的DNA对左旋和右旋圆偏振光的吸收程度不同。

这种差异吸收被称为圆二色性，会导致透射光呈椭圆偏振，该现象以椭圆度来衡量。CD 谱中特定波长处的两个正峰证实了茎环结构的存在。

加入EDTA以螯合镁离子，抑制ATP酶活性。

螯合后CD光谱发生变化——在特定波长处出现负峰和一个宽的正峰——表明在没有ATP水解的情况下，茎环构象被破坏。

使用高透明度石英比色皿收集圆二色光谱。可选用矩形或圆柱形比色皿。清洁比色皿时，先用清水多次冲洗，然后在比色皿中加入水或缓冲液进行扫描，以检查是否清洁。

进行反应时，使用经PAGE纯化的DNA寡核苷酸。快速冷却时，将DNA在加热块上于94摄氏度加热3分钟，然后立即置于冰上冷却。缓慢冷却时，在94摄氏度加热DNA 3分钟后，使其以每分钟1摄氏度的速率冷却至室温。

为记录基线光谱，依次在1.5毫升离心管中设置共计5个对照反应。所有反应的反应体积均保持为300 µL。

为记录圆二色光谱，依次在1.5毫升离心管中设置总共五个实验反应。

为记录扫描结果，先打开气体，然后开启圆二色光谱仪。10到15分钟后，打开光源，启动水浴，并将样品池温度设置为37摄氏度。

接下来，打开圆二色光谱软件，将温度设置为 37 摄氏度，波长范围设为 180 至 300 纳米，每点采集时间设为 0.5 秒，扫描次数设为 5 次。然后，点击 Pro-Data Viewer，新建一个文件，并根据实验细节和日期对其进行重命名。

接下来，通过移液混合对照反应和实验反应，然后将反应混合物逐个小心转移至比色皿中，确保无气泡产生。

若进行时间进程实验，将反应体系在37摄氏度下孵育所需时间，然后进行扫描。向含有DNA、ATP、镁离子和蛋白质的缓冲液中加入EDTA，以终止ATP水解反应。为完全抑制ATP酶活性，可提高EDTA浓度并延长孵育时间。

在软件中从相应的反应中减去基线，并在圆二色光谱软件或数据绘图软件中对数据进行平滑处理。然后，绘制波长对平均残基椭圆率的图谱并分析峰形。